兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究.doc

1 兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究【摘要】目的: 建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法, 并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养, 分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT 比色法测定细胞生长曲线。结果: 两种方法培养的细胞在原代、第1 代形态相似, 消化法培养的细胞代数维持低于组织块法; 对数生长期时,组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛( );在 16h后, 消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法( )。结论: 选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞, 且具有经济实用性;角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。【关键词】角膜; 上皮细胞; 原代细胞培养; 兔角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础, 近年来, 随着研究深入, 对角膜细胞成分培养提出了更高要求。在此, 我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法, 以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细 2 胞培养方法,现将实验结果报告如下。 1 材料和方法 实验材料 实验动物健康新西兰白兔 6只, 雌雄不限, 体重 ~ kg, 由东南大学实验动物中心提供与饲养。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明,无眼前节病变。 主要试剂和仪器 DMEM/F12 ( Gibco,USA) ,胎牛血清(中美合资兰州民海生物), 胰蛋白酶( Gibco,USA ), EDTA ( 乙二***四乙酸二钠, AMRESCO 分装), MTT ( Sigma , USA ), CO2 培养箱( Heal Force HF121UV ) ,倒置相差显微镜( OLYMPUS CKX41 , Japan ) ,酶标仪( Bio-rad Model 860 )。 培养液的制备 3 采用 DMEM/F12=1 ∶1 的混合液, 内含 10 mmo1 · L-1HEPES 、 20% 胎牛血清、 100 × 103 U· L-1 青霉素和 100 × 103 U· L-1 链霉素, pH 值 ~ 。 实验方法 取材取新西兰白兔 6 只,共 12 眼,以空气栓塞法处死兔,无菌条件下迅速摘取眼球,用 PBS 反复冲洗后浸泡于含青、链霉素 1 000 × 103 U· L-1 4℃ PBS 中 10 min, 待用。 消化法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上将眼球用 PBS 冲洗 2~3 次,沿角膜缘取下完整角膜,用 DMEM/F12 培养液冲洗 1~2次;在 50mm 培养皿中加 % 胰蛋白酶或 %胰蛋白酶- % EDT A 混合消化液约 1 ml, 将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中, 培养箱中消化 20~ 30 min 后翻转角膜片, 轻轻冲洗上皮面, 将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化; 在培养皿中再次加入消化液, 置培养箱中消化 10 min 后终止消化;将两次消化的细胞悬液离心 6~8 min(1 000 4 r· min-1) , 弃上清, 加入全培养液( 内含 10 mmo1 · L-1HEPES 、 20% 胎牛血清、 100 × 103 U· L-1 青霉素、 100 × 103 U· L-1 链霉素, pH 值 ~ ), 吹打混匀。计数制成 5× 105 ~1× 106 ml- 1 细胞悬液,接种于培养瓶中。置 37℃、 5%CO2 和 95% 空气培养箱中培养, 3d 后首次换液,以后每周更换 2~3次。 组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上,将眼球用 PBS 冲洗 2~3 次后沿角膜缘取下完整角膜, 放入加有培养液的培养皿中; 在体式显微镜下完整撕下角膜上皮面,剪成约 1 mm3 大小角膜上皮片,均匀平铺于培养瓶中, 翻转培养瓶加入全培养液, 置培养箱中培养 2~4h 后轻轻翻转培养瓶,使培养液慢慢浸过组织块; 或将角膜上皮片均匀平铺于 24 孔板中,置于培养箱中 2~4 h, 然后缓缓加入全培养液。将培养瓶或 24 孔板置于 37℃、 5%CO2 恒温培养箱中培养,3d 后首次换液, 以后每周更换 2~3 次。 角膜上皮细胞的传代原代培养至上皮细胞 80 %融合后用 PBS 冲洗 2 次,加入 %胰蛋白酶- % EDTA 1 ml 冲洗 1 次,再加入消化液 5 1~2 ml, 倒置显微镜下观察细胞形态, 待细胞变圆, 细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化,收集细胞悬液,离心 6~8 min (1 000 r·