tPAVEGF165双基因静电纺丝涂层机械瓣膜的构建及体外实验研究.pdf

华中科技大学
博士学位论文
tPA-VEGF165双基因静电纺丝涂层机械瓣膜的构建及体外实验研
究
姓名:王刚
申请学位级别:博士
专业:心血管外科
指导教师:张凯伦
2011-05
华中科技大学博士学位论文
中文摘要

双基因静电纺丝涂层机械瓣膜的构建及体外实验研究

第一部分: tPA-VEGF165 真核表达载体的构建

【目的】:通过克隆从模板中获得人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)和人血管内皮细胞生长因子
165(VEGF165)目的基因片段,然后将其分别插入真核表达载体 pIRES 质粒的两个多克隆位点,
以构建携带目的基因的两个载体质粒 pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165。
【材料和方法】:按照人 tPA 基因的 CDS 序列()和人 VEGF165 基因的序列
( NM_001025368 )设计引物,引物分别包含内切酶 EcoR I 和 Xba I 酶切位点,以
-Myc-His B(-)/tPA 质粒和 cDNA 文库为模板,PCR 扩增获得目的基因片段,琼脂糖凝
胶电泳检测并切胶回收 DNA;分别用内切酶 EcoR I和 Xba I将 pIRES 质粒线性化,然后把 tPA
和 VEGF165 目的基因片段重组入多克隆位点,并调换插入顺序,分别获得 pIRES-VEGF165-tPA
和 pIRES-tPA-VEGF165 两个质粒;所构建的表达载体质粒转化感受态细胞 DH5α,筛选单克隆,
菌落 PCR 检测目的基因,然后将阳性重组质粒送检测序。
【结果】: 琼脂糖凝胶电泳结果表明 PCR 扩增目的基因,获得大小约为 1721bp 和 1151bp 的 DNA,
与人 tPA 和 VEGF165 基因序列相符合;菌落 PCR 表明 pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165
两个质粒转化感受态细胞均可得到阳性转化子,而他们的测序结果表明载体质粒中所包含的基因
序列与 Pubmed 中其对应的 CDS 序列相比,插入方向正确,tPA 基因中的 CTG(编码 Leu)同义
突变为 CTA(编码 Leu),VEGF165 基因中同样也仅出现数个同义突变,均不会影响蛋白表达。
【结论】: 成功构建出了携带人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)和人血管内皮细胞生长因子 165
(VEGF165)目的基因片段的两个载体质粒 pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165。


第二部分: tPA-VEGF165 真核表达载体的体外转染实验

【目的】:通过体外转染实验,检测所构建的真核表达载体 pIRES-VEGF165-tPA 和
pIRES-tPA-VEGF165 质粒能否转染内皮细胞,并检测目的基因在转录,翻译,以及蛋白分泌和功
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能方面的情况,同时比较 pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165 质粒在转染和蛋白表达方
面有无区别。
【材料和方法】:转染试剂 Attractene Transfection Reagent 介导 pIRES-VEGF165-tPA 和
pIRES-tPA-VEGF165 质粒体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞(),同时,以表达绿色荧光
蛋白的 pGFP 质粒与载体质粒按照 1:1 的比例共转染 细胞,以绿色荧光蛋白作为示踪
标志,计算转染后 12h,24h 和 48h 瞬时转染效率,设置转染空 pIRES 质粒和空白 PBS 作为对照;
荧光实时定量 RT-PCR 检测各组细胞中 tPA 和 VEGF165 的 mRNA 相对含量,Western blot 检测细
胞中的蛋白表达情况;提取转染后细胞上清,ELISA 检测上清液中所含有的分泌蛋白 tPA 和
VEGF165 浓度,并用 MTT 试验和 tPA 活性检测试剂盒评价蛋白功能。
【结果】: 通过计算转染后绿色荧光下阳性细胞的比率发现,转染后约 24h,阳性细胞比率最高,
随后逐渐减少,pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165 质粒转染效率分别约为±
和±,两组之间差异无统计学意义(>);荧光实时定量 RT-PCR 和 Western blot
检测发现转染 pIRES-VEGF165-tPA 和 pIRES-tPA-VEGF165 质粒组细胞中 VEGF165 和