小鼠精原干细胞分离富集和培养 (1)硕士论文.pdf

上海交通大学医学院硕士学位论文
小鼠精原干细胞分离富集和培养

摘要

目的成年小鼠睾丸中约有 108 个细胞,其中约有 2×104 个是精原干细
胞,仅占睾丸生精上皮细胞总数的 ~%,精原干细胞数量太少不利
于体外培养。分离和富集精原干细胞成为精原干细胞体外培养能否成功
的前提条件。寻找分离和富集小鼠精原干细胞有效方法。
方法出生 6-8 天小鼠为实验对象,先用 %胰酶 1mM EDTA 消化
睾丸 10min,用胎牛血清终止消化,用一次 40-um 孔径的滤器过虑制成单
细胞悬液,30%percoll 不连续密度梯度法离心富集精原干细胞,再根椐
未分化精原干细胞表面 ()阳性 CD117(c-kit)阴性特点用流式
细胞仪将精原干细胞分选出来,并在体外进行培养尝试。
结果 30% percoll 密度梯度离心前 CD117(c-kit)阳性细胞占 ±
%, 阳性细胞占 ±%,二者都阳性细胞占 ±
%,CD117 ±%;离心后 CD117(c-kit)
阳性细胞占 ±%, 阳性细胞占 ±%,二者都阳性
细胞占 ±%,CD117 阴性 阳性细胞占 ±%;
CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后比较差异无显
著性(P>), 阳性细胞和 CD117 阴性和 阳性细胞所占百
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分比前后比较差异有显著性(P<);采用 CD117 和 作为标志分
子,percoll 离心后细胞悬液经 FACS 分选后获得细胞纯度为 %,细
胞活率为 %,获得细胞数为 ×106 细胞。
结论 %胰蛋白酶 1mM EDTA 为经济有效的幼鼠精原干细胞方
法,30%percoll 富集精原干细胞仅提高 1 倍,不能满足体外研究和培养
要求,对 percoll 密度梯度离心后细胞悬液,联合应用两种标志分子进行流
式分选是获得高纯度精原干细胞有效的方法,为精原干细胞进一步奠定
基础。

关键词: 小鼠,,精原干细胞,分离,富集, CD117, , 体外培养


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Isolation, enrichment and in vitro culture of
pup male spermatogonial stem cell

ABSTRACT
Spermatogonial stem cells (SSCs),is the only stem cells that are capable
of transmitting ic information to subsequent generations in adult
animals,have abilities to self-renew and differentiate into spermatozoa.
Therefore, SSCs are not only the study object of stem cell biology, but also
the valuable resource of in vitro spermatogenesis, gene analysis and
functional genomics. Apparently, in vitro culture of SSCs would be a very
valuable means for the mechanism studies of SSC self-renewal and
differentiation. This had long been difficult because of several problems. First,
the number of SSCs in the testis is very low-there are only about 2×104 SSCs
out of 108 total cells in an adult mouse testis, that is 1 in 5000 . Second, these
cells could not be distinguishe