启动子,荧光素酶报告基因.docx

启动子,荧光素酶报告基因启动子活性分析一、二、实验目的:分析启动子活性实验原理:荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?ReporterAssay System试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。在双荧光素酶系统中,除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外,另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。三、实验材料:Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem试剂盒, PBS,细胞裂解液,96孔, 四、五、实验设备:单通道多标记荧光检测仪实验方法及步骤: 1)启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量μg的原则转染细胞,36h后收获细胞; 2)96孔板吸弃细胞培养基,PBS冲洗细胞一次,加入1×PLB细胞裂解液 20μl,置于室温震荡裂解20min; 3)轻轻吹打细胞,取10μl细胞裂解液加入50μlLuciferaseAssayReagent, 轻轻震荡混匀,立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定FireflyLuciferase活性; 4)读数后立即加入50μlStop&Glo?Reagent轻轻震荡混匀,读取Renilla Luciferase活性; 5)所得的结果为各个实验样品的FireflyLuciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔,整个实验独立重复3次。实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差(mean±)表示。六、注意事项 。 ,求平均值。七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验 :Dual-GloTMLuciferaseAassySystem组成如下:?Dual-Glo?萤光素酶缓冲液?Dual-Glo?萤光素酶底物?Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液?Dual-Glo?Stop-Glo?底物 ?细胞信号转导途径?启动子/增强子?受体结合?病毒/细胞相互作用?转录因子?药物诱导作用或“效果” –制备含有luc/Rluc的DNA –转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/对照的–所有的缓冲液存于室温,所有的底物存于–20°C 两步加入试剂:加,读,加,读 : 实验前,将Dual-Glo?萤光素酶试剂平衡到室温 :(来自:写论文网:启动子,荧光素酶报告基因)向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo?萤光素酶试剂,混匀。例如96孔板,一般会加入75ul与孔中培养基等体积的试剂。 ,测萤火虫荧光值。荧光值在加入Dual-Glo?萤光素酶试剂后2小时之内较稳定。 :向待测细胞板每孔中加入与开始的培养基等体积的Dual-Glo?Stop&Glo?试剂,混匀。与第二步类似,若用的是96孔板,则加入75ul试剂。注意:Dual-Glo?Stop&Glo?试剂要在加入Dual-Glo?萤光素酶试剂后4小时之内加入。 ,测海肾的荧光值。荧光值在加入Dual-Glo?Stop&Glo?试剂后2小时之内较稳定。