人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建.doc

人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建.doc:..人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建王春红李哲王明菡邓丽丽王欢[摘要]目的:本研究通过克隆人多巴***受体(dopaminereceptor,DRD)1基因的启动子区,构建贪有该棊因启动子序列的双荧光素酶报告棊因载体并检测其活性,为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法:以人静脉血基因组DNA为模板,通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体,测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告棊因质粒pGL3-Basic,构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体,采用阳离子脂质体法与内对照质粒PGL3-TK共转染人真核细胞系HEK-2293,同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒PGL3-TK共转染作为阴性对照组,化学发光仪检测相对荧光强度。结果:通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确。与阴性对照组相比,该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性。结论:成功构建丫含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告棊因载体,为研宂该棊因的转录调控提供了基础工具。[关键词]多巴***受体D1基因双荧光素酶报告基因启动子克隆D0l:.-:110034,辽宁沈阳,沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室前言多巴***作为一种N源性神经递质,主要通过多巴***受体调控其功能。多巴***受体是能与多巴***特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴***受体(dopaminereceptor,DRD)为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族,目前己分离出五种类型(DRD1〜DRD5)。人类DRD五种亚型的棊因位于不同的染色体上。DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带(),全长3489bp[1]。人和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸,其同源性为91%,而跨膜部分的同源性为96%。DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏隔核和嗅结节等部位表达丰富,这些区域中DRD1受体的表达量也非常高[2】。DRD1基因启动子区的多态性位点会通过调控转录活性来影响多巴***受体1的产量,进而影响多巴***神经递质的代谢,奋研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症,双相情感障碍等疾病的发生有关[3-7]。目前,对DRD1基因启动子区的研究其多,但仍未得出一个统一的结论,且很多研宄多局限在对单独某一位点与疾病的冋顾性分析,并未对具体调控做细致的分析。本研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载体,细胞转染验证其表达活性,为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基础工具。材料与方法人DRD1基因启动子克隆取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3ml置于试管中,应用酚-***仿法提取基因组DNA,所得DNA沉淀加适量的TE(10mol/LTris-HCI,lmol/)溶解,溶解后的DNA于4°C保存。,根据pGL3-Basic载体(Promega,美国)多克隆位点选定限制性内切酶(见图1)。划线部分分别为Kpnl和Bgl2的酶切识别位点,引物委托生物公司合成(TaKaR