sodmda研究生实验.ppt

NBT法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活力植物组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定Planta,2019,215:1022背景知识植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化:如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统:酶促防御系统:SOD、CAT、POD和APX等非酶促抗氧化剂:ASA和GSH等丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一,它的产生还能加剧膜的损伤。因此,丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度,也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是一个常用指标。背景知识实验目的实验原理实验材料与设备实验步骤注意事项结果比较分析思考题NBT法测定SOD活力实验目的了解胁迫反应的具体机制(膜脂过氧化&抗氧化)了解抗氧化防护酶的测定方法,掌握NBT法测定SOD活力实验原理SOD催化下列反应:2O2.-+2H+→H2O2+O2本实验依据SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。光SODH2O2核黄素+甲硫氨酸O2.-+NBT→甲腙(560nm)光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。SOD酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系,一般以引起50%光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位材料、仪器设备及试剂植物生理生化实验p172-173(一)材料:小麦叶片(二)仪器设备:;;;;。(三)试剂:()195mmol/L甲硫氨酸(Met):取1g材料于预冷的研钵中,加5ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,15000g(4℃)离心15min,上清液即为SOD粗酶液。:取5ml试管4支,2支为测定管,另2支为对照管。反应体系中各试剂的终浓度为130mmol/LMet,75μmol/LNBT,4μmol/L核黄素,100nmol/LEDTA,按下列次序及量(ml)加入各溶液:(不加酶液而用缓冲液,为最大还原管)设为对照,其中1支对照管置于暗处,其它3支置4000Lux光C2023(或阳光)下反应20min(显蓝色),反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定2支试管的OD560SOD活性计算SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。(Ack-AE)×VAck××W×VtAck照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)SOD总活性(U/g)=