实验考马斯亮蓝测蛋白质含量.doc

实验7考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学****一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有***橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成蓝色的蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比,因此可用于蛋白质含量测定。反应2—5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时。—。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、***、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定。三、材料、试剂与器具(一)试剂1、染色液:取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中,加100ml85%磷酸,加水稀释至1升。棕色瓶保存,该染色液可保存数月,若不加水可长期保存,用前稀释。2、标准蛋白溶液:。3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制,浓度控制在10—30mg/ml(二)器具1、试管及试管架2、移液管(1ml,5ml)3、可见光分光光度计四、操作步骤(一)标准曲线的制作1、取7支试管,、将试管摇匀,放置20分钟。3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。4、以A595nm为纵坐标,标准蛋白色质浓度为横坐标,绘制标准曲线。(二)样品的测定1、取一支试管,,、将试管摇匀,放置20分钟。3、比色测定吸光值A595nm,对照标准曲线求得蛋白质的浓度。五、注意事项1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠,试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低,因而当蛋白质浓度较大时,标准曲线稍有弯曲,但直线弯曲程度很轻,不致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始,力争1hr内完成,否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。六、实验报告绘制标准曲线,并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。七、思考题1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么?2、考马斯亮蓝法有什么优缺点Bradford法的优点是(1)灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。(2)测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右,颜色在5min至20min之间稳定性也很好。(3)干扰物质相对其它方法少。缺点是(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法