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烟草瞬时转化.doc

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本氏烟草()瞬时表达及相关实验方法:农杆菌介导的烟草瞬时转化:A、实验步骤:根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌。将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜。*估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率。3、~,1000g,5min离心收集农杆菌。4、用2mlInductionmedium(withoutAS)轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液。5、重复步骤4。6、所得沉淀用1mlInductionmedium重悬。7、室温放置1~4小时8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液(组合详见下文)。用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。*使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人;注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染。B、试剂:Inductionmedium:MES--,4℃保存,用时稀释100倍。1MMgCl2过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍。,分装(避免反复冻融),-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。C、关于表达时间:烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过。D、关于侵染液浓度:~。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

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烟草瞬时转化.doc

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