Fc对DCT细胞共培养中细胞因子表达的影响.doc

可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养中细胞因子表达的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:王炯坤, 邢飞跃, 季煜华, 方志远, 郭中锋, 潘山
【摘要】目的: 研究可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养体系中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα表达水平的影响。方法: 应用IL4和GMCSF诱导培养小鼠骨髓细胞, 流式细胞术检测髓系树突状细胞(DC)分化标志CD11c; 将等量的淋巴细胞与之共培养, ELISA检测共培养上清TGFβ1的含量, Luminex100检测IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的含量。结果: 可溶性Jagged1/Fc处理组TGFβ1和IL10的水平与DAPT对照组之间无统计学意义(), 而IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的水平升高()。结论: Jagged1/Fc能促进DCT细胞相互作用导致IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的水平上调。
【关键词】 Jagged1/Fc 细胞因子树突状细胞 T细胞
树突状细胞(dendritic cell, DC)是专职的抗原提呈细胞, 能够诱导初始T细胞分化为不同类型的效应T细胞, 以引起不同的免疫反应。通过细胞膜表面的配体
受体的相互作用以及分泌的细胞因子, DC和T细胞共同调控着适应性免疫反应的方向。Jagged1是哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一, 与T细胞受体Notch结合后, 激活Notch信号通路, 从而影响外周T细胞的分化。目前尚不清楚Notch究竟是如何调控外周T细胞分化。虽然有些报道认为在抗原提呈细胞所过表达的Jagged1能通过Notch信号通路诱导CD4+初始T细胞分化为调节性T细胞, 但是Amsen的研究表明Jagged1Notch的相互作用实际上促进了CD4+初始T细胞向Th2细胞分化[1]。此外, 也有报道认为Notch信号通路的激活并非CD4+初始T细胞分化所必需的, 在抗原提呈细胞上过表达Jagged1所引起的免疫耐受可能是抑制T细胞的增殖、活化以及相关细胞因子的产生的结果[2, 3]。尽管对于Jagged1在T细胞分化中的作用还未达成一致的意见, 但是从已有的研究来看Jagged1确实能够通过Notch信号通路影响T细胞的活化、增殖以及相关细胞因子的产生。鉴于从细胞因子水平, 在国内外尚无利用可溶性Jagged1/Fc对外周T细胞分化的影响进行比较全面研究的报道。因此, 我们通过研究可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养体系中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα等细胞因子表达的作用,旨在探讨Jagged1和外周T细胞分化的关系。
1 材料和方法
材料雄性SPF级C57BL/6小鼠(8周龄, 质量18~22g), 购自广东省医学实验动物中心。RPMI1640培养液、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为GibcoBRL公司产品。L
谷氨酰***、β巯基乙醇和DAPT均购自Sigma公司。rmIL4、 rmGMCSF购自Peprotech公司。Jagged1/Fc为RD Systems公司。TGFβ1试剂盒、多重细胞因子试剂盒购自UPSDATE公司。680型酶标仪购自BIORAD公司。LuminexTM100蛋白液相分析仪购自Luminex公司。FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。
方法
淋巴细胞的制备将C57BL/6小鼠断髓处死, 无菌分离双侧腋窝、锁骨下、腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结, 去除被膜, 机械研磨, 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞, 用冷PBS 1200 r/min离心5 min。洗涤细胞2次, 细胞重悬于100 mL/L胎牛血清RPMI1640培养液中, 调整细胞密度为1×107/L。
骨髓细胞的制备参照Lutz MB法进行, 并略加改良。取C57BL/6小鼠断颈处死, 无菌分离完整的股骨及胫骨, 剪断骨头两端, 用PBS冲洗骨髓腔, 充分吹打骨髓细胞团, 收集骨髓细胞悬液离心(300 g, 5 min)。用PBS重悬后加入红细胞裂解液, 37℃避光作用8 min后PBS洗2次(300 g, 5 min)。细胞重悬于含100 mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养液中, 调整细胞密度为2×109/L。
细胞共培养取上述制备的骨髓细胞, 按1×107细胞数/孔铺于6孔培养板中, 第0、