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PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的: 观察PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响。方法: 体外培养人胰腺癌细胞株PANC1, 使用罗格列***和GW9662细胞分别处理PANC1细胞, RTPCR检测PANC1细胞中PTEN基因表达的变化; SABC法检测PTEN蛋白表达的变化, FCM法检测PTEN蛋白表达的百分率的变化。结果: PPARγ激动剂罗格列***能够诱导抑癌基因PTEN的高表达, 同时抑制剂GW9662能够抑制抑癌基因PTEN的表达, 并呈一定的量效关系。结论: 胰腺癌细胞中PPARγ的表达与抑癌基因PTEN的表达呈一定的平行关系, PPARγ可能通过一定信号转导通路调节抑癌基因PTEN的表达, 从而发挥抗肿瘤的作用。
【关键词】 PPARγ胰腺癌罗格列***基因治疗
近年胰腺癌发病率在国内外呈上升趋势, 起病隐蔽, 发展迅速, 又缺乏有效的早期诊断和系统治疗方法, 胰腺癌早期诊断以及治疗水平均较低, 促使人们不断寻求其新型有效的治疗分子靶点[1]。目前, 胰腺癌基因治疗还处于探索阶段, 抑癌基因将在胰腺癌基因治疗中发挥重要作用。研究发现人类胰腺癌表达PPAR
γ, PPARγ配体可以抑制巨噬细胞的活化以及浸润, 是肿瘤新生血管形成重要的调节因子[2], 激活PPARγ能够产生抗胰腺癌生长的效应。PTEN基因, 是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因, 参与细胞周期调控, 同时调节细胞正常生长和发育[3]。有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失[1], 而10q正是PTEN基因位点所在。近年来随着对肿瘤发病机制的不断深入研究, 发现PPARγ、 PTEN与胰腺癌发生、发展有着密切的联系。本研究中通过体外培养人胰腺癌细胞株, 给予PPARγ激动剂罗格列***, 利用RTPCR、免疫细胞化学、流式细胞术(FCM)检测等方法, 观察胰腺癌细胞株中抑癌基因PTEN表达的影响, 为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持, 为胰腺癌基因治疗提供新思路。
1 材料和方法
材料人胰腺癌细胞株PANC1(human pancreatic cancer cells, PANC1), 购自意大利ISTBanca公司。RNA提取试剂(TRIzol Reagent)、 Taq DNA聚合酶、反转录酶Super scriptⅢ、 DL 2000 marke、 DMEM培养基均为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。引物由大连宝生公司合成。格列***为葛兰素史克公司产品。GW9662为Sigma公司产品。PTEN antibody、二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记为武汉博士德公司产品。
方法
引物设计通过人PTEN信号肽和编码区基因序列设计引物, 在GenBank中获得所需PTEN的基因序列, 由大连宝生生物技术有限责任公司合成。人PTEN的基因序列: sense primer 5
′CCA GAC ATG ACA GCC ATC3′; antisense primer 5′GAA CTT GTC G TCG3′。人βactin的基因序列: Sense primer 5′GAG GAT CTT CAT GAG GTA GTC TGT CAG GTC3′; antisense primer 5′CAA CTG GGA CGA CAT GGA GAA GAT CTG GCA3′。
细胞培养 PANC1细胞从液氮中取出后, 迅速置于37℃水浴解冻复苏, 加入37℃预热无血清DMEM培养液, 800 r/min离心5 min, 弃上清; 细胞沉淀加入DMEM完全培养液(内含150 mL/L胎牛血清、 g/L HEPES、青、链霉素各100 U/mL)重悬, 置于75 cm2塑料瓶, 在含50 mL/L CO2的37℃孵箱里贴壁生长至融合, 隔日换液, 当细胞生长至80%~90%融合时, g/L胰蛋白酶消化传代。选择生长良好的PANC1细胞, 接种于6孔细胞培养板, 接种密度为1×104/孔。
细胞总RNA的提取使用罗格列***和GW9662细胞分别处理PANC1细胞, 使用PBS溶液(含1 μmol/L DMSO, )处理空白对照组细胞。罗格列***组, 细胞培养体系中分别加入1 μmol/L、 10 μmol/L罗格列***溶液(1 μmol/L DMSO), 50 mL/L CO2、 37℃孵育2、 6、 12、 24、 48 h; GW