RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响.doc

RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:田维军赵金伟宋晓斌
【摘要】目的应用RNAi技术沉默胰腺癌细胞株中survivin基因对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和增殖的变化。方法靶向survivin的RNAi载体转染胰腺癌细胞,Western印迹检测基因沉默效果,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果 survivin基因沉默效率可达85%;MTT检测显示,干扰组survivin沉默细胞增殖抑制与非特异性质粒对照组相比显著增高()。流式细胞术显示,干扰组细胞凋亡百分率显著高于非特异性质粒对照组();G2/M期显著高于非特异性质粒对照组(),而S期则显著降低()。结论 survivin基因沉默可引起胰腺癌细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。
【关键词】 RNAi;survivin;细胞凋亡;细胞周期;胰腺癌
胰腺癌的发生、发展以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程,其中生存素(survivin)是一类在胰腺癌的发生、发展中起非常重要作用的癌基因〔1〕,其参与细胞多种重要生物学过程,包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等〔1,2〕。survivin在胚胎期表达丰富,而在成熟组织中则表达极少或缺失,但在病理情况下,包括胰腺癌的很多恶性肿瘤组织中均发现有survivin的高水平表达,并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力呈正相关〔1,3〕。survivin的过表达和激活不仅与预后不良密切相关,而且能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,是胰腺癌基因治疗的潜在靶点之一〔4,5〕。本研究选择survivin分子作为干扰靶点,检测沉默该基因后对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为进一步研究survivin基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。
1 材料与方法
主要试剂
人胰腺癌细胞株PC
3购自中国科学院上海生物研究所细胞库,以含10%胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM(Gibco公司)培养基,37℃,5%CO2孵箱(SANYO)培养。M 2000(美国Gibco公司),ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司),小鼠抗人单克隆survivin抗体(Santa Cruz公司)。干扰质粒pGenesil2、非特异性siRNA(武汉市晶赛生物工程技术有限公司),pGensilsiRNAsurvivin质粒由本室构建。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。
细胞培养与细胞转染
转染前1 d将对数生长期的胰腺癌细胞株PC3以2×105个/孔接种于6孔培养板,细胞铺板在2 ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基中,24 h内、细胞融合达40%~60%时进行转染,将s
iRNA M2000复合体加到培养板中(转染方法按试剂盒说明书操作),转染体系为500 μl,siRNAs终浓度为100 nmol/L。
Western印迹检测基因沉默效果
收集细胞,用PBS缓冲液漂洗3次,加入200 μl 细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 m