磁性纳米四氧化三铁协同顺铂作用于肺癌A549细胞的初步研究.doc

磁性纳米四氧化三铁协同顺铂作用于肺癌A549细胞的初步研究
【摘要】目的: 检测磁性纳米四氧化三铁(NanoFe3O4)联合顺铂(DDP)作用于人源肺腺癌细胞A549后相关凋亡抑制基因、耐药蛋白的表达,研究其增强化疗敏感度的机制。方法: 用MTT法检测NanoFe3O4聚合DDP对A549细胞增殖凋亡的影响;流式细胞术分析凋亡细胞比例;RTPCR检测抗凋亡基因bcl2、survivin、1表达水平变化;蛋白印迹法分析耐药蛋白MRP及其表达率。结果: 25 μg·ml-1 NanoFe3O4能有效增强DDP的细胞毒作用,提高A549的凋亡率;与单独用药组相比,NanoFe3O4联合DDP组的抗凋亡基因bcl2、1和耐药蛋白MRP表达下调,差异具有统计学意义(P<);survivin基因表达未见明显改变。结论: NanoFe3O4联合DDP可通过下调抗凋亡基因bcl2、1及耐药蛋白MRP的表达,增强化疗药物敏感度。
【关键词】磁性纳米四氧化三铁; 顺铂; 肺腺癌细胞系A549; 凋亡; 多药耐药
顺铂(DDP)是一种金属铂化合物,含有类似烷化剂的双功能基团,以顺铂为主的联合化疗已成为肺癌经典治疗方案[1]。但随之出现的化疗敏感度下降、肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)等问题,影响其疗效,降低了患者的生存率[2]。利用纳米载体聚合携载化疗药物逆转肿瘤细胞的多药耐药以增强化疗敏感度是一项探索性研究[3]。本实验通过检测磁性纳米四氧化三铁(NanoFe3O4)联合顺铂(DDP)作用于人源肺腺癌细胞系A549后相关凋亡抑制基因及耐药蛋白表达的动态变化,研究其增强化疗敏感度的机制。
1 材料和方法
材料
人肺腺癌细胞系A549由南京军区总医院肿瘤中心惠赠,NanoFe3O4由东南大学生物科学与医学工程学院提供,DDP为购自南京制药厂的铂龙注射液(质量浓度1 mg·ml-1),RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司,胰蛋白酶、MTT、DMSO试剂盒购自Sigma公司,AnnexinⅤFITC/PI试剂盒购自BD公司,bcl2、survivin、1及GAPDH基因引物由上海英骏生物科技有限公司合成,RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司,MRP抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。酶标仪为BIORED550型,流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型。
方法
细胞培养 A549细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,每3~4 d传代1次。
MTT法检测细胞增殖凋亡效应取对数生长期细胞接种于96孔板,×104个细胞,孵育过夜后,选取抑制效果最明显的25 μg·ml-1 NanoFe3O4作为药物干预浓度。、5、10、20 μg·ml-1的DDP以及上述浓度的DDP合并25 μg·ml-1的NanoFe3O4组,另设空白调零组、阴性对照组以及NanoFe3O4组,每组设3个复孔,培养24 h,用MTT法测每孔吸光度值(A490 nm)。抑制率=(1-药物组平均A490 nm/对照组平均A490 nm)×100%。
Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期的A549细胞,按处理条件分为A组(空白对照组)、B组(DDP组)、C组(DDP加NanoFe3O4组)和D组(NanoFe3O4组)。B组加5 μg·ml-1DDP,C组加5 μg·ml-1DDP和25 μg·ml-1NanoFe3O4,D组加25 μg·ml-1NanoFe3O4。加药24 h后收集细胞,PBS洗涤2次,采用AnnexinⅤ和PI荧光染色流式细胞术定量分析细胞凋亡率。
RTPCR检测抗凋亡基因bcl2、survivin、1表达按上述分组处理收集细胞,Trizol法提取总RNA,按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作。bcl2:上游引物5′GGGAGAACAGGGTACG
ATAA3′,下游引物5′GAACTCAAAGAAGG3′,产物长度452 bp;survivin:上游引物5′
GCATCTC3′,下游引物5′CCAAGGGTTAATTCTTCAA
ACT 3′,产物长度255 bp;1:上游引物5′CCG
CCAGCAAGGAAGAAA 3′,下游引物5′GAGG
GCTCACAAT3′,产物长度276 bp;内参为GAPDH。RTPCR产物行琼脂糖凝胶电泳,数字成像系统拍照