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冰冻切片免疫组化步骤.doc

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冰冻切片免疫组化步骤需要准备的材料APES包被的载玻片PBS()4%多聚甲醛PBST(含Tween-20)PBST-G()冰冻切片取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内,之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内,让盒底部接触液氮(小盒及组织块切勿浸入液氮内),大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用,或置于恒温切片机冰冻切片。切片厚度4-8um(5um),对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片,以增加组织片的粘附性。切片后如不立即染色,必须吹干,储存于低温冰箱内保存。免疫组化染色步骤固定:取出切片,室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins,PBS冲洗三次(冲洗可以采用侧斜淋洗,也可至于平皿中摇晃)。打孔:如果是需要染细胞内的蛋白,用曲拉通(TritonX-100)打孔:%TritonX-100的PBS中10mins,之后用PBS洗3次,每次5mins。如果是染膜蛋白的,不需要曲拉通打孔。封闭:将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins,封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本,。孵化:组织样本浸于一抗(用含1%BSA的PBST稀释),放于湿盒中,室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次,每次5mins。浸入二抗(1%BSA的PBST溶液),室温1h。PBS洗3次,每次5mins。染色:-1ug/mL的DAPI或Hoechst中,染色1min,PBS淋洗三次。封片:用盖玻片封片,指甲油固定,保存与4或-20℃。

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