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Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响        [10-09-0714:32:00]    作者:张颖肖谦    编辑:studa20【摘要】 目的探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。方法将原代培养的心肌细胞随机分为:①正常对照组(N组);②高糖组(H组);③高糖+Ghrelin组(G组)。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测各组心肌细胞凋亡,分光光度法检测心肌细胞内caspase3活性的变化。结果与N组比较,H组心肌细胞凋亡明显增加,caspase3活性显著升高;与H组比较,G组心肌细胞凋亡数量明显减少,caspase3活性明显降低(均P<)。结论Ghrelin可能通过降低caspase3活性抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。【关键词】 Ghrelin;高血糖;心肌细胞;凋亡caspase3 心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一,长期心肌细胞凋亡的发生,将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究发现,Ghrelin可以抑制多种细胞的凋亡,如成骨细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等,但Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此,本实验以高糖环境培养心肌细胞,Ghrelin作为干预因素,旨在探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响,从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。 1 材料与方法  材料  细胞来源  新生1~3d的SD大鼠的心肌细胞(重庆医科大学动物实验中心提供)。  主要试剂  Ghrelin(美国PhoenixBiotech公司),DMEM培养基(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),Ⅱ型胶原酶及胰酶(均购于Sigma公司),PBS、αactin单克隆抗体、SABC试剂盒、TUNEL检测试剂盒及DAB显色试剂盒(均购于武汉博士德生物技术公司),caspase3活性检测试剂盒(购于南京凯基生物公司)。  实验方法  原代心肌细胞的分离与培养  取出生1~3d龄SD大鼠10~15只,无菌条件下取心脏,仔细剥离心包膜去除心房及大血管,剩余组织于PBS液中漂洗多次,放于青霉素小瓶侧壁上,用眼科剪将心组织剪成约1mm3碎块。%胰蛋白酶,反复吹打后36℃水浴消化7min,静置,待自然沉降后弃上清。%胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶1混合液,置36℃水浴消化5~8min,静置后将上清液移入10ml离心管中,反复吹打至无细胞团块后用等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化,一般经8~10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以1000r/min离心8min,弃去上清液后将细胞重悬于含15%胎牛血清的DMEM培养液,然后接种于50ml培养瓶,37℃,5%。轻轻吸出上层细胞悬液,调整接种密度,将细胞接种于24孔板(板底铺盖玻片),置37℃,5%CO2培养箱中培养(培养液中加入5,以抑制成纤维细胞增殖),培养48h换液,以后每2d换液1次。  台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率