Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响.doc

1 Ghrelin 对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响【摘要】目的探讨 Ghrelin 对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。方法将原代培养的心肌细胞随机分为: ①正常对照组(N组);②高糖组(H组);③高糖+Ghrelin 组(G组)。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( TUNEL ) 检测各组心肌细胞凋亡, 分光光度法检测心肌细胞内 caspase 拟3 活性的变化。结果与N 组比较, H 组心肌细胞凋亡明显增加, caspase 拟3 活性显著升高;与H 组比较, G 组心肌细胞凋亡数量明显减少, caspase 拟3 活性明显降低(均 P< ) 。结论 Ghrelin 可能通过降低 caspase 拟3 活性抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。【关键词】 Ghrelin ;高血糖;心肌细胞;凋亡 caspase 拟3 心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一,长期心肌细胞凋亡的发生, 将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔 1〕。近期研究发现, Ghrelin 可以抑制多种细胞的凋亡, 如成骨细胞、 2 胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等,但 Ghrelin 对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此, 本实验以高糖环境培养心肌细胞, Ghrelin 作为干预因素, 旨在探讨 Ghrelin 对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响,从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。 1 材料与方法 材料 细胞来源新生 1~3d的 SD 大鼠的心肌细胞(重庆医科大学动物实验中心提供)。 主要试剂 Ghrelin( 美国 Phoenix Biotech 公司), DMEM 培养基( Gibco 公司), 胎牛血清( Hyclone 公司),Ⅱ型胶原酶及胰酶( 均购于 Sigma 公司), PBS 、α拟 actin 单克隆抗体、 SAB C 试剂盒、 TUNEL 检测试剂盒及 DAB 显色试剂盒( 均购于武汉博士德生物技术公司), caspase 拟3 活性检测试剂盒(购 3 于南京凯基生物公司)。 实验方法 原代心肌细胞的分离与培养取出生 1~3d龄 SD 大鼠 10~ 15只, 无菌条件下取心脏, 仔细剥离心包膜去除心房及大血管, 剩余组织于 PBS 液中漂洗多次, 放于青霉素小瓶侧壁上, 用眼科剪将心组织剪成约 1 mm3 碎块。加入 5 倍体积的 %胰蛋白酶, 反复吹打后 36℃水浴消化 7 min ,静置,待自然沉降后弃上清。剩余沉淀再加入约5 倍体积 %胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶ 1 混合液,置 36℃水浴消化 5~8 min , 静置后将上清液移入 10 ml 离心管中,反复吹打至无细胞团块后用等体积含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化, 一般经8~10 次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以 1 000 r/ min 离心 8 min , 弃去上清液后将细胞重悬于含 15 %胎牛血清的 DMEM 培养液, 然后接种于 50 ml 培养瓶, 37℃,5% CO2 培养箱中孵育 h 去除贴壁的成纤维细胞。轻轻吸出上层细胞悬液, 调整接种密度, 将细胞接种于 24 孔板(板底铺盖玻片) ,置 37℃,5% CO2 培养箱中培养( 培养液中加入 5拟溴脱氧尿嘧啶 mmol/L, 以抑 4 制成纤维细胞增殖) ,培养 48h 换液,以后每 2d 换液 1次。 台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率将 %台盼蓝溶液与细胞悬液等比例混匀, 滴入细胞计数板, 2 min 后于倒置相差显微镜下计数,未着色的为活细胞,呈蓝色的为死细胞, 计算细胞存活率〔% ,活细胞数/( 活细胞数+ 死细胞数)× 100% 〕,重复 3 次。 心肌细胞纯度鉴定细胞培养第 3 天取出细胞爬片, 4 %多聚甲醛固定 30 min 后,用 mol /L PBS 漂洗 3 次。加入 3% H2O2 消除过氧化氢酶,封闭血清,室温封闭 30 min 后加入以1 ∶ 300 稀释的兔抗大鼠特异性α拟 actin 抗体于 4℃孵育过夜。然后分别用荧光标记的山羊抗兔IgG抗体 37℃避光孵育 60 min 。 PBS 清洗 3 次后立刻荧光显微镜下观察,绿色荧光染色的细胞即为阳性心肌细胞。阳性细胞百分率(%) =阳性细胞数/ 细胞总数× 100% ,重复 3 次。 实验分组 5 原代心肌细胞培养 3 d后进行实验分组,分为以下 3 组:①正常对照组(N组): 葡萄糖浓度为 mmol / L;②高糖组(H组) :葡萄糖浓度为