基因表达差异.doc

基因差异表达技术?ó?2?_?ák_club.,???5à???2基因差异表达技术?ó?2?_?ák_club.,???5à???2真核生物中,从个体的生长、发育、衰老、死亡,到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答,本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有 30000个不同的基因,但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达,而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着,这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。生物体表现出的各种特性,主要是由于基因的差异表达引起的。?ó?2?_?ák_club.,???5à???2由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交(differential hybridization)、扣除(消减)杂交(subtractive hybridization of cDNA,SHD)、mRNA差异显示(mRNA differential display, DD)、抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)、代表性差异分析(represential display analysis,RDA)、交互扣除RNA差别显示技术(reciprocal subtraction differential RNA display)、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)、电子消减(electronic subtraction)和DNA微列阵分析(DNA microarray)等。?ó?2?_?ák_club.,???5à???2一、差别杂交与扣除杂交?ó?2?_?ák_club.,???5à???2差别杂交(differential hybridization)又叫差别筛选(differential screening),适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性,后来又发展出了扣除杂交(subtractive hybridization)或扣除cDNA(subtractive cDNA cloning),它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。?ó?2?_?ák_club.,???5à???2(一)差别杂交?ó?2?_?ák_club.,???5à???2从本质上讲,差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因,同时亦可有效地用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。目前,差别杂交筛选法在基因的分离工作中有着相当广泛的用途。?ó?2?_?ák_club.,???5à???2差别杂交的技术基础十分简单,它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息,而重要的是耍拥有两种不同的细胞群体:在一个细胞群体中目的基因正常表达,在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA类型的总mRNA群体,其二是不含有目的基因mRNA类型的总mRNA群体。因此,可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交,对由表达目的基因的细胞总 mRNA构建的库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时,所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应,在X光底片上呈现黑色斑点,而使用不存在目的基因的mRNA探针时,除了含有目的基因的菌落外,其余的所有菌落都呈阳性反应,在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板,便可以挑选出含目的基因的菌落,供作进一步研究使用。?ó?2?_?ák_club.,???5à???2差别杂交筛选技术已被成功地用于分析爪蟾和粘菌的发育问题。这两个应用例子表明,处于不同发育状态或阶段的丰度相差5倍的特异的mRNA种是能够被检测出来的。生长因子调节基因(growth factor-regulated gene)的克隆,是差别杂交成功应用的一个典型例子。我们知道,血清中含有生长因子,因此用血清处理处于静止期的细胞时,便会迅速诱发生长因子调节基因进行表达。所以,分别从静止期细胞培养物和经血清激活3小时的物中提取的poly「A」mRNA制剂,在mRNA种类上是有差别的,至少后者比前者多出了一种生长因子调节基因的mRNA类型。用从激活细胞中分离的poly「A」mRNA反转录合成的cDNA与λ噬菌体载体重组,构成cDNA文库,