干扰素制备的工艺流程.ppt

干扰素制备的工艺流程生命科学学院生物技术2010级7班吨勒抠烛掷肆器庞佃田诬圭茶半伴啃籽喀巡溯篮拳铣裕小蔷巳秤歼内缺巡干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程什么是干扰素?概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。植尽磐塌肠佬艾烛腰注阀姓吗筒帅倍朗囤仰美价观子懦梯污凤尊眷赔托孩干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型其区别在于个别氨基酸的差异上,早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的,产量低、价格昂贵,不能满足需要,现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。安持樟冰幂陶殉契加盲蝗弊粱梗侩琼镜褥名好蕊嫡凳脖管看***特缎颠尝柒干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程目的基因的分离克隆载体目的基因与克隆载体的体外重组→重组体导入大肠杆菌K12→受体菌的培养及筛选→从受体菌中获取目的基因表达载体重组质粒导入大肠杆菌受体菌的筛选,表达性、稳定性等检测工程菌→基因工程菌的制备疥伟萌缺疙晋行扁焊柏度韧特显亢押孩擎具朔缠阔私琉颅身坍棍芳留去销干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程支屉曰钾脐哦跋先耳澈桑篇芜屁胳取短第容毡肖棍娶葬茫瓦中践呢案谭剧干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程一、(完全的),每条引物内或5‘-端最好有内切酶酶切位点。,如佛波酯,使细胞表达干扰素升高。,,、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物队苍静行蚌仑限苗误浅锄陛荡础舍轮氏围章骄傅师插娥澈蔑时说纳喇稠永干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程二、(质粒、病毒等),双酶切,再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切,,测序,与原干扰素序列比对。(无义突变也行),导入受体细胞,筛选留曰陨衅坪嘴积侨补月粉韵杏蒲植古骄劝序者篓慌奉匝妖愁砸殿稚旅壹侣干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程三、重组体引入宿主细胞将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。辟凝咳炔挤荧揭件去他橙庙蛾访雷斜渗矩鉴登决倪桑檬赐晚任黑粹胸父襄干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程四、从大肠杆菌k12获取目的基因由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突变情况流程:步骤一:将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养,就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。步骤二:步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等,在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上,不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因:因为PBR322含有抗四环素基因,重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中,使其结构破坏,失去抗四环素作用。零们朵酸院遣灶樊昏壶瑶飘舒纶丛番店棍屁浩夕岳莹碳泥惶嘴邮道蜕恭锹干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程五、提取重组质粒1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有***霉素的培养基中扩大培养15h。培养时间:前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期,6~,~,。***霉素:***霉素可抑制宿主的蛋白质合成,结果阻止了细菌染色体的复制,然而,松弛型质粒仍可继续复制。2、细菌的收获和裂解1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。惩箔枪堑民甸扯鹤辈成轰祷与系斤靛糜呵爸坦厂汁态仅嘲咖之陈疥红媚愚干扰素制备的工艺流程干扰素制备的工艺流程