基因组学研究进展论文.doc

基因组学研究进展论文.docTILLING技术姓名:罗洁学号:M201071486院系:生命科学与技术学院摘要:TILLING技术是一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了-•种高通量,低成木,规模化和高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。木文简要介绍了TILLING技术的原理和特点,并对其在植物功能基因组学,作物品种改良和在生物进化及检测多态性中的应用作了初步探讨。Abstract:TILLINGtechnologyisakindofbrand-icsstudymethod,itprovidesahighthroughput,lowcost,,andinitsfunctionalgenomics,cropcultivarimprovementandinbiologicalevolutionandtestingpolymorphismapplicationwasdiscussed关键词:TILLING技术反向遗传学点突变"严一刖5随着越来越多的植物的基因组测序的完成,以表型筛选为主的正向遗传学方法正逐步被反向遗传学方法替代而成为功能基因组学研究的主要方法。反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学研究的方法,但这3种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程,作为常规方法仅限应用于极少数物种⑴。基因组靶向定位诱导损伤技术(targetinginducedlocallesionsingenomes,简称TILLING)是美国华盛顿Hutchinson癌症研究中心以Henikoff为首的科学家发展建立的⑵。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合,快速有效地从化学诱变剂***磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate,EMS)诱变产牛的突变群体中鉴定出点突变,这一-全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。在TILLING技术基础上发展起来的Ecotilling(ecotypicTILIING)技术不用化学诱变,可以宜接探知存在丁•特定群体中某个基因或基因群的多态性(等位基因),识别单碱基突变(SNP)、小片段插入、微卫星重复等,为基因功能研究和生物进化提供重要信息⑶。最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突变进行检测(McCallumetal.?2000a;2000b)o为了进一步提高这个方法的效率,适应大规模筛选的要求,Colbert等(2001)对TILLING作了改进。他们将所获PCR片段先用特异性识别错配碱基的内切酶酶切界源双链核酸分了,再用变性的序列胶电泳分离酶切产物,用标准的图像处理程序分析点突变的存在。有几种酶己经被用于错配碱基的特异性识别、切割,包括S1核酸酶(Howardetal.,1999)和丁4核酸内切酶VH(Youiletal.,1996)O廿前,使用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELI酶,它是一•种从芹菜(celery)中分离出的植物所特有的核酸内切酶(Oleykowskietal・J998)。CELI酶能够识别错配碱基并在错配碱基的引端进行切割,再用变性的序列胶(PAGE)分离酶切产物,能够将超过lkb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此,改进的TILLING充分运用了CELI卿和凝胶电泳技术,从而使其成为一个低成木、高通量的筛选突变基因的技术平台。TILLING技术的基本原理是:首先是运用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变而获得突变群体,提取DNA并把多个待测样品DNA混合建立突变群体及其DNA池,然后利用特异性引物对特定DNA区段进行PCR扩增,通过变性和复性过程得到异质双链。如果有突变发生,那么形成的异质双链中将含有错配碱基。利用特异性的核酸内切酶识别错配碱基的异质双链并在错配处切开双链,最后进行变性聚丙烯酰***凝胶电泳检测。如果发现阳性结果,则再在混合的样品屮逐一检测,最后确定阳性样本。TILLING技术路线TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变,再用设计的特异性引物进行PCR扩增,而后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子,再用特片切割错配的内切酶CELI酶切,最后变性处理后采用双色聚内烯酰***凝胶(PAGE)电泳检测分