血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定.doc

血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定.doc血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备及鉴定作者:石琦,单冰,高晨,姜慧英,张宝云,韩俊,董小平【摘要】 冃的:制备血管内皮生长因了(VEGF)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以重组HisTrxVEGF1165蛋白为抗原,通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备VEGFmAb,制备小鼠腹水并测定其效价、染色体数目及免疫球蛋白亚类,用Westernblot方法分析其特异性。结果:成功筛选出能稳定分泌的VEGFmAb杂交瘤细胞株4E4H5,制备腹水的ELISA效价为1:106;染色体数目为105条;抗体分型为IgGl亚型,k轻链;Westernblot证实所获得的mAb可与VEGF全长蛋白发生特异性反应,但是与融合蛋口的标签蛋口HisTrx不发牛反应。结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的VEGFmAb,为建立能够用于肝癌诊断的血清VEGF检测技术提供了参考。【关键词】血管内皮生长因子单克隆抗体酶联免疫吸附试验血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)最早是由Leunq等[1]于1989年在牛垂体星状细胞培养液中提纯的蛋白质。它是胚胎发生和创伤愈合过程屮启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原,也是一种血管形成和血管通透性诱导因子,在血管发生和形成过程中起着重要的调控作用[2]。肿瘤的生长和转移是一个多步骤的复朵过程,其中肿瘤血管的生成起重耍的作用。迄今为止,VEGF被认为是肿瘤组织中促血管生成的最主要的血管生长因了[3]o近年来,人们已经在人和动物的多种肿瘤组织,包括肝癌细胞屮都发现VEGF的过度表达,且表达水平随着癌变程度增加而逐渐升高。另外,VEGF的表达与血管牛:成及细胞增生程度相关,且其过度表达影响肿瘤的侵袭和转移[4]。基于这些理论基础,我们在原核系统中表达了含165个氨基酸的VEGF全长蛋白,以此为免疫原制备了小鼠抗人VEGF全长蛋白的单克隆抗体(mAb),并对其特性进行了鉴定,获得了能稳定分泌抗VEGFmAb的杂交瘤细胞株。1材料和方法1材料HisTrxVEGF1165蛋白、pET32a载体、Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞株由本室制备保存;弗氏完全、不完全佐剂购自Sigma公司;次黄瞟吟氨基蝶吟胸腺卩密唳核昔(IIAT)及次黄瞟吟胸腺卩密唳核营(HT)购自Hyclone公司;PEG1500购自Roche公司;antiVEGFmAb购自R&D公司;辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗小鼠IgG购自PIERCE公司;小鼠mAb分型检测试剂盒购自Roche公司;ECL检测试剂盒购自PerkinElmer公司;ELTSA显色液购自北京万泰生物公司;BALB/c纯系小鼠(6〜8周龄,雌性,质量17-20g),购自北京生物制品研究所动物部。,充分乳化,经腹腔注射免疫BALB/c小鼠。以后每隔2周进行1次免疫,采用100ngHisTrxVEGF1 165蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合、乳化后经腹腔注射免疫,共免疫4次。,进行细胞融合[5]:末次免疫后3d取脾,同时眼部取血,离心分离血清备用。将小鼠脾细胞与