临床医学论文 人cbl 基因真核表达载体的构建及表达.doc

临床医学论文 人cbl 基因真核表达载体的构建及表达.doc临床医学论文•人cbl基因真核表达载体的构建及表达[Abstract]AIM::,sequencedandthensubclonedintoeukaryoticexpressingvectorpcDNA3・l(+)・::TheeukaryoticexpressingvectorencodinghumancblisconstructedanditexpressesflagcblfusedproteincorrectlyinCOS-7cells.[Keywords]cbl;polymerasechainreaction;c1oning,molecular;geneexpression【摘要】Fl的:构建带有fl銘标签的人cbl基因真核表达载体,并检测其在真核细胞屮的表达•方法:以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N末端带上含24bp的flag标签,克隆到pGEMTeasy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬吋转染COS7细胞‘:测序证实以pEFHAcbl为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒PcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染C0S7后检测到预期Fl的蛋白的表达•结论:成功构建了N末端带flng标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞C0S7屮表达.【关键词】cbl;聚合酶链反应;克隆,分子;基因表达0引言Cbl(casitasBlincagclymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白,在哺乳类屮有Cbl、,可以介导与不同的细胞内分子结合,在细胞活化过程屮可作为接头分子或支架分子参与信号转导;同吋该分子屮的RING结构域能够与泛索结合酶E2结合,作为泛索连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化一蛋片酶体降解,因此参与细胞内信号转导的负调控机制[1]•近年来的研究表明,突变的Cbl可成为癌基因[2];而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子(如受体型蛋白酪氨酸激酶,RTK)发生突变后则不再受Cbl的负调控[3]•我们成功构建了N—末端融合有fl迎标签的cbl基因的真核表达载体,并采用脂质体法转染培养的COS7