荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制.doc

荧光定量PCR之绝对定量分析——。将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。*Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,经过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系*由样品CT值,*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增,而且扩增效率相同*标准品必须是经过准确定量的(我们一般见的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计)*标准品必须是标准化的(例如,同一化的细胞数)*在每组实验时,必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品能够是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也能够是比扩增片段长的纯化后的PCR产物,当然也能够是基因组DNA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品能够适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法:1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算::将标准品依次进行10倍稀释,ASP-×108copy/ul标准曲线的绘制(1cycle=1min)设置对照:×107、×106、×105、×104、×103、×102、×101的标准样品各一个,设空白对照PCR反应:以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线标准品的标准曲线图XLog 7 6543 2 (E)计算:E=10-1/斜率=10-1/-=,E%=(-1)×100%=104%,将CT值代入线性方程:=-,因此X=(-)/(-)===50118copies核酸拷贝数的计算一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA50ug/ml=ssDNA33ug/ml=ssRNA40ug/ml核酸浓度=(OD260)×(dilutionfactor)×[33或40或50]=ng/ulMW代表克/摩尔,单位dolton:1dolton即表示1g/mol1摩尔=(拷贝数)平均分子量(MW):dsDNA=(碱基数