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荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
1. 绝对定量定义
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
* 由样品CT值,就可以计算出样品中所含的模板量
2. 绝对定量标准品
标准品的一些标准
* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增,并且扩增效率相同
* 标准品必须是经过准确定量的(我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计)
* 标准品必须是标准化的(例如,同一化的细胞数)
* 在每组实验时,必须用相同的阈值设定来确定CT值
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物,当然也可以是基因组DNA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法:
1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii
1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv
1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算:详见核酸拷贝数的计算
4. 实例
标准品的制作:将标准品依次进行10倍稀释,ASP-3700 ×108copy /ul
标准曲线的绘制(1cycle=1min)
设置对照:×107、×106、×105、×104、×103、
×102、×101的标准样品各一个,设空白对照
PCR反应:以不同浓度标准品作为模板
标准品的扩增曲线
标准品的溶解曲线
标准品的标准曲线图
扩增效率(E)计算:
E=10-1/斜率=10-1/-=,E%=(-1)×100%=104%
,将CT值代入线性方程:
=-,所以X=(-)/(-)=
Quantityunknow==50118 copies
核酸拷贝数的计算
一、分步推理如何计算核酸拷贝数
1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml
核酸浓度=(OD260)×(dilution factor)×[33或40或50]=ng/ul
MW代表克/摩尔,单位dolton:1dolton即表示1g/mol
1摩尔=(拷贝数)
平均分子量(MW):dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿