非洲猪瘟pK205R.doc

非洲猪瘟 pK205R 、 p54 蛋白克隆、表达、纯化及其免疫学诊断方法的建立研究生:刘文俊导师:孙怀昌教授专业:预防兽医学一、研究背景二、目的及意义三、技术路线四、研究进展五、后期研究工作研究背景非洲猪瘟 ASF ( African swine fever ) ?非洲猪瘟病毒样病毒科唯一成员; ?双股 DNA 病毒,虽是 DNA 病毒,却是在细胞浆内增殖; ?唯一一种 DNA 虫媒病毒; ? p54 、 pK205R 蛋白抗原性较强,在 ASF 血清学诊断中有很高的灵敏性和特异性(均在 90% 以上); ? p54 ( E183L )都能被 IgG 和 IgM 抗体反应所识别; ?抗 pK205R 、 p54 的抗体在病毒感染早期就可以检测到,便于“早发现,早处理”! ELP 蛋白表达纯化系统 Target protein Intein Elastin-Like-Polypeptide 通过温度、盐离子浓度, PH 改变,机械离心等,即可获得纯化蛋白。经济,高效,易于操作! 目的及意义?本病的症状和病变和猪的其他出血性疾病,特别是经典型猪瘟很难区分,而且没有疫苗可以使用,所以快速而准确的实验室诊断就显得尤为重要。?2 个重要结构蛋白的表达纯化为 ASF 抗体检测和血清学诊断提供大量抗原。构建构建 Elp Elp 系统表达系统表达参照参照 GENEBANK GENEBANK 发表序列设计引物发表序列设计引物已构建的已构建的 pET-EI- pET-EI- αα- -I I FN FN 克隆克隆αα-IFN -IFN 纯化产物纯化产物以以 ASF ASF 阳性阳性和阴性血清为一抗和阴性血清为一抗做做 Western Western blotting blotting 分析分析以两种重组蛋白以两种重组蛋白建立建立 ASF ASF 的间接的间接 ELISA ELISA pET-EI-K205R 克隆的构建 pET-EI-E183L 克隆的构建 pET-EI-E183L 8179bp E183L BsrG I Sal I 泳道泳道 1 1: : K205R K205R 基因基因 PCR PCR 产物产物 M:λ DNA/ Hin dⅢ Marker 泳道泳道 1 1: : E183L E183L 基因基因 PCR PCR 产物产物 M:λ DNA/ Hin dⅢ Marker 泳道 1:pET-EI-K205R Sal I、 BsrG I双酶切 M:λ DNA/ Hin dⅢ Marker 泳道 1: pET-EI-E183L Sal I、 BsrG I双酶切 M:λ DNA/ Hin dⅢ Marker pK205R 的 ELP 纯化产物 SDS-PAGE 图 p54 的 ELP 纯化产物 SDS-PAGE 图?? Pkss-EI Pkss-EI 载体的构建载