硫化氢对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制的探讨.pdf

南华大学
硕士学位论文
硫化氢对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制的探讨
姓名:杨丝丝
申请学位级别:硕士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:姜志胜;唐小卿
20070501
原创性声明

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作者签名: 日期: 年月日




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作者签名: 导师签名: 日期: 年月日
硫化氢对 PC12 细胞氧化应激损伤的
保护作用及其机制的探讨

硕士研究生:杨丝丝
指导教师:姜志胜教授唐小卿副教授
专业:病理学与病理生理学

摘要

目的: 以 H2O2 损伤 PC12 细胞为神经细胞氧化应激损伤的模型,探讨硫化氢(hydrogen
sulfide, H2S)对神经细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探讨硫化氢抗神经细胞氧化
应激损伤的机制。

方法:用普通光镜和 Hoechst 33258 荧光染色观察 H2O2 作用 24h 后 PC12 细胞形态和
核形态的变化;用四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium
Bromide,MTT)比色法检测细胞增殖状况;DNA Ladder 抽提试剂盒和碘化丙啶
(propidium iodide, PI)染色流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡;双氢罗
丹明 123(Dihydrohodamine 123, DHR123)染色后,镜下观察和 FCM 测定 PC12 细胞
的 DHR123 荧光强度,以明确细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的变
化情况;罗丹明 123(Rhodamine 123, Rh123)染色后,镜下观察和 FCM 测定 PC12 细
胞的 Rh123 荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,
△Ψm)的变化情况;Western Blot 检测细胞 Bcl-2 和 Caspase-3 蛋白质的表达。

结果:
对 PC12 细胞的氧化应激损伤作用:
1
①MTT 结果显示,用不同剂量 H2O2(50、100、200、400、600µmol/L)作用 PC12 细胞
24h 后,细胞存活率随药物浓度的增加依次下降。
②普通光学显微镜下观察发现,与正常细胞比较,细胞经 H2O2( 200、400µmol/L )处理
24h 后,细胞数明显减少,细胞形态多为圆形,体积缩小,折光性减弱,贴壁能力降低。
③细胞经 Hoechst 33258 染色后,在荧光显微镜下观察发现,正常 PC12 细胞染色质分
布均匀,为弥漫均匀的低强度荧光;经 H2O2( 200、400µmol/L )处理 24h 后,PC12 细胞
有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞。
④细胞经 PI 染色 FCM 结果显示,PC12 细胞自然凋亡率为 %,经 200 和 400µmol/L
H2O2 处理 24 小时后,分别可引起 %和 %的细胞凋亡(P<)。
对 H2O2 损伤 PC12 细胞的保护作用
H2S 减轻 H2O2 对 PC12 细胞活性的抑制作用
①MTT 结果显示,400、800µmol/L NaHS 均可明显降低 200、400µmol/L H2O2 对 PC12
细胞的抑制率(P<)。
②普通光学显微镜观察发现,与 H2O2(200µmol/L )损伤组比较,合用 NaHS(400µmol/L)
处理后,圆形的,体积缩小的,折光性减弱,贴壁能力降低的 PC12 细胞数量明显减少。
H2S 对抗 H2O2 诱导 PC12 细胞凋亡
①DNA Ladder 结果显示,200µmol/L H2O