生化实验技术指导书.docx

生化实验技术指导书.docx生化实验技术指导书《生物技术大实验》实验指导书生物技术教学部常平安舒坤贤谢永芳编重庆邮电学院生物信息学院2005年3月1日冃|Jn《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程,是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课稈。该实验课程偏重于分子生物学实验教学,通过此实验课稈,学生不仅学****到最基木的分子生物学技术,而且学****到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进,LI新月异。分子生物学技术的广泛应用,在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用,而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分了生物学技术己广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发冇学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期,由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基木技能和动手能力的培养都离不开实验室,离不开实验课上的训练,很多理论上的原理都需要到实验课上去验证,很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基木条件Z-o虽然目前的分了生物学实验教材版木众多,但针对木科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设,促进本学科实验课的开设,我们参考了国者2005年3月1目录实验一质粒的提取和纯化 3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测 6实验三PCR产物的TA克隆 9实验以感受态大肠杆菌细胞的制备 12实验五重组DNA转化大肠杆菌 12实验六PCR扩增基因特异片段 15实验七DN***段的回收及纯化 19实验八PCR法快速鉴定重组载体 22实验九限制性DNA探针制备 38实验十以Southern印迹杂交 41实验十五Northern印迹杂交 44实验十六荧光原位杂交(FISH)技术 47实验I•七外源基因在哺乳细胞小的表达及其检测实验十八生物芯片技术技术 实验二I*蛋白质组技术本技术路线 :了解碱裂解法制备质粒的原理,掌握质粒的小量制备方法。实验原理:质粒DNA的抽提是基因T稈操作屮最常用与最基本的技术,现己有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法;利用酸性、低离了强度时超螺旋在水相屮,开环、线型分了在酚相屮进行分离的酸酚法;利用耗基磷灰石在特定的条件下(8nwl/L尿索,=)只吸附双链DNA的拜基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链,质粒DNA保持双链)等。木实验选做的是碱法。裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过稈。对于不同的菌要选用不同的方法,通常有煮沸法、非离了型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言,非离了型去污剂法较温和,适用于抽提10kb左右的质粒;而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈,只能抽提小于10kb的质粒。常用的离了型去污剂是SDS、非离了型去污剂有TritonX-100等。分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下:大肠杆菌的染色体约有4700kb长,在处理细胞过程屮都断裂成不同长度的双链DN***段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA屮的氢键被破坏,于是染色体DNA的双链分离成单链;而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏,并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调冋屮性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分了,而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子,通过离心的方法很容易将二者分开,达到分离的目的。纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有备种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚/***仿、***仿/异戊醉,使蛋白质变性剂而除去,同时,***仿有强烈的溶脂倾向,对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。***仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉,而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。***仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱,主耍用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+***仿((1:1))一***仿(或***仿/异戊醇24:1),处理,根据实验情况也可考虑省略第一或第二步,但切记不可将***仿(***仿/异戊醉)的处理步骤省略掉。抽提过稈完成麻的水溶液屮仍有痕杲的酚、***仿等,可用乙醉沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩,且同时也更换了整个缓冲系统,但DNA也有一定的损失。实验10g细菌培养用酵母