实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素.doc

实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
一、实验目的
了解ELISA的基本原理,及其优缺点; 掌握间接ELISA法的试验操作过程。
二、实验原理
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应,微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的特异性单克隆抗体,加入黄曲霉毒素标准品(或样品溶液)及黄曲霉毒素B1 酶标记物,标准品(或样品溶液)中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体,没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育,结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物,加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色,在450nm 处测量,吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。
三、实验器材
1、ELISA试剂盒
其组成如下:
包被抗体的反应板 48孔
A试剂:样品稀释液 l瓶
B试剂:AFB1标准溶液 l套(0, , , , 1, 2 ng/mL)
C试剂:酶标抗原 l瓶
D试剂:酶标抗原稀释液 l瓶
E试剂:浓缩洗涤液 l瓶
F试剂:显色底物液a l瓶
G试剂:显色底物液b l瓶
H试剂:终止液 l瓶
反应板框架 l块
2、仪器
酶标仪(内置450nm滤光片)
50µL微量移液器及配套吸头
恒温培养箱(0℃-50℃)
冰箱(4℃-8℃)

调速振荡器或超声波清洗器
离心机5000r/min
玻璃器皿:具塞锥形瓶,烧杯,分液漏斗,普通漏斗,量筒,具塞试管,滴管,移液管等
小型粉碎机或碾钵
其它:滤纸,吸水纸等
四、实验步骤
1、实验准备
样品处理:详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”
脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)
(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中,(1+1)溶液,于振荡器上剧烈震荡15min,过滤,弃去l/4初滤液,收集试样滤液,此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准,用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释(如100µL样品提取液+100µL样品稀释液,总稀释10倍),即为待测样液。
花生
样品去皮粉碎(刀切或剪切),。(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚),于振荡器上剧烈震荡l0min,过滤于分液漏斗中,静置分层,放出下层甲醇水提取液,此液为样品提取液,根据样品的国家允许量标准,用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释(如100µL样品提取液+300µL样品稀释液,总稀释20倍),即为待测样液。
一般饲料及原料
,(1+1)溶液,于振荡器上剧烈震荡15min,过滤,弃去1/4初滤液后收集滤液,此液为样