标准的PCR反应体系.doc

标准的PCR反应体系.doc标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应休系:10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10〜lOOmol模板DNA01〜2ugTqDNA聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至lOOulPCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性収决F引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核甘酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:引物长度:15-30b,常用为20b左右。引物扩增跨度:以200-500B为宜,特定条件下可扩增长至IOkb的片段。引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC垠好随机分布,避免5个以上的瞟吟或喘咙核甘酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度01〜1UH101或10〜lOOmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul吋),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质杲与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用吋应配成高浓度后,〜75,小量分装,-20£冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50〜200umolL,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它儿种吋(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键坏节之一,传统的DNA纯化方法通滋采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主耍功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与***,。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩増。RNA模板提叹-般采用异硫孰酸IM或蛋白酶K法,要防止RNse降解RNA。g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一•般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15〜20mmolL为宜。g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特并扩增,浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90〜95°C变性,再迅速冷却至40〜60°C,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70〜75°C,在TqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100〜300b吋)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94°C变性,65°C左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)0变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93°C〜94°Clniin足以使模板DNA变性,若低于93°C则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40°C〜60°C,可使引物和模板发生结合。山于模板DNA比引物复杂得多,弓|物和模板Z间的碰撞结合机会远远高于模板互补链Z间的碰撞。退火温度