标准的pcr反应体系.docx

标准的 PCR 反应体系 PCR 反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------- ----- 标准的 PCR 反应体系: 10× 扩增缓冲液 10ul 4种 dNTP 混合物各 200umolL 引物各 10~ 100mol 模板 DNA 01~ 2ug TqDNA 聚合酶 25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素:参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 g2+ 引物: 引物是 PCR 特异性反应的关键, PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上, 只要知道任何一段模板 DNA 序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30b ,常用为 20b 左右。②引物扩增跨度: 以 200-500b 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。③引物碱基: G+C 含量以 40-60% 为宜, G+C 太少扩增效果不佳, G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布,避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3' 端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物 3' 端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性: 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度 01~ 1umol 或 10~ 100mol ,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种 TqDNA 聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2。 5U( 指总反应体积为 100ul 时) ,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系, dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后, 以 1NH 或 1Tris 。 HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 70~ 75 ,小量分装, -20 ℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中, dNTP 应为 50~ 200umolL ,尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制) ,如其中任何一种浓度不同于其它几种时( 偏高或偏低) ,就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 g2+ 结合,使游离的 g2+ 浓度降低。模板( 靶基因) 核酸模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败与否的关键环节之一, 传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质, 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜, 并解离细胞中的核蛋白, SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质, 特别是与 DNA 结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与***仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份, 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本, 可采用快速简便的方法溶解细胞, 裂解病原体, 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离, 直接用于 PCR 扩增。 RNA 模板提取一般采用异硫***酸胍或蛋白酶 K 法, 要防止 RNse 降解 RNA 。 g2+ 浓度 g2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的 PCR 反应中,各种 dNTP 浓度为 200umolL 时, g2+ 浓度为 15~ 20mmolL 为宜。 g2+ 浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异扩增,浓度过低会降低 TqDNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置: 基于 PCR 原理三步骤而设置变性- 退火- 延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链 DNA 在 90~ 95℃变性,再迅速冷却至 40~ 60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至 70~ 75℃,在 TqDNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因( 长度为 100 ~ 300b 时)