肝细胞生长因子抗细胞凋亡效应的研究.pdf

温州医学院硕士学位论文肝细胞生长因子抗细胞凋亡效应的研究中文摘要目的克隆肝细胞生长因子(HGF)基因,构建其重组真核表达载体;观察HGF拮抗经足叶乙甙()处理后5株细胞的凋亡发生;转染gaji细胞,;构建动物模型,观察HGF的抗凋亡和促血管新生的生物学效应,为研究HGF的生物学效应做相关基础工作。方法 ,行逆转录聚合酶链反应获HGF基因eDNA,与载体pMDl9-TSimple连接,构建重组克隆载体pMDl9-T simple-HGF。:fDH5n并行氨苄青霉素和洳筛选,采用菌落直接PCR、Mlu I 和SalI双酶切及序列分析等方法,证实目的片段的存在和序列正确。 -T Simple- DH5n增菌后,提取重组载体行M/u I和SalI双酶切,行琼脂糖凝胶电泳分离后将目的片段进行胶回收并测定浓度, -HGF。 DH5a并行潮霉素B(1 00 pg/m1)筛选,经菌落直接PCR、Mlu I和SalI双酶切等方法确定目标片段的存在。 %的基础上,对上层胶琼脂糖浓度(%~%) 和细胞浓度(100个/孔"-'5000个/孔)进行选择,改良琼脂糖半固体培养体系。取对数生长期的Raji细胞,以终浓度为1×105个/rnl分别接种于含10--,200嵋佃l潮霉素B 的RPMI 1640培养液,于37℃、5%C02作静置培养,以培养14天后仍有Raji细胞存活的最低潮霉素B浓度作为筛选用浓度。 。37℃、5%C02常规静置培养 24h后,采用50“g/ml潮霉素B进行筛选。以未处理Raji细胞和仅加脂质体Raji细胞为空白对照,。取筛选后存活组细胞提取总RNA,行RT-PCR,电泳,检测HGF基因的存在以确定成功转染。 、7、15代HGF基因转染后Raji细胞培养物提取总RNA,逆转录后采用实时荧光定量PCR,检测HGF mRNA的表达水平并评价其表达稳定性,以未转染 。 ,采用Western blot、细胞免疫化学法定性检测HGF蛋白的表达。此外,分别收集第l、7、15代HGF基因转染后Raji细胞培养物上清液,采用ELISA法定量检测HGF蛋白的表达,并评价HGF蛋白表达的稳定性。以未转染Raji细胞组、。 、穿刺培养和单层细胞培养, 置37℃、5%C02作常规静置培养。第3天起每天观察细胞的生长情况至14天,观察集落形成情况,分别评价HGF基因转染对Raji细胞的增殖、侵袭和迁徙的影响。 (、、HeLa宫颈癌细胞系、A549非小细胞肺癌细胞系、Raji淋巴瘤细胞系) 分别以Ixl06/孔接种至6孔板,37℃、5%C02常规静置培养24h后, 处理6h,加入HGF(终浓度为100 ng/m1),37℃、5%C02常规静置培养24 h,再按相关实验进行操作。。 K-8细胞毒性试验于96孔板每孔内加入100山细胞,,置37℃,5%C02细胞培养箱中孵育12h,,孵育l~4 h,经酶标仪在450 nm测定吸光度。 (Raji、)或细胞爬片(、HeLa、A549)方式制片,用95% ,水洗后,行HE染色,光镜下检测并计数。 ,浓度约为l×107/Illl。取95山细胞悬液,加5山吖啶橙贮存液, 混匀。吸一滴于洁净玻片上,盖玻片封片,激光共聚焦显微镜下观察并计数。 1