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实验一 DNA 提取
实验一 DNA 的小量制备
小量法提取植物基因组 DNA(CTAB 法)
实验目的 :
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用 ,人们经常需要提取高分子量的植物 DNA, 用于构建基因文库、基因组 southern 分析、酶切及克隆等 ,这就是研究基因结构与功能的重要步骤。本实验目的就是学****从植物材料中提取与测定 DNA 的原理并掌握 CTAB 提取 DNA 的方法 ,进一步了解 DNA 的性质。
实验原理
细胞中的 DNA 绝大多数以 DNA- 蛋白复合物 (DNP) 的形式存在于细胞核内。提取 DNA 时 ,一般先破碎细胞释放出 DNP,再用含少量异戊醇的***仿除去蛋白质 ,最后用乙醇把 DNA 从抽提液中沉淀出来。 DNP 与核糖核蛋白 (RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大 ,利用这一特性可将二者分离。以 NaCl 溶液为例 :RNP 在0、14mol/L NaCl中溶解度很大 ,而 DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的 1％。当 NaCl 浓度逐渐增大时 ,RNP的溶解度变化不大 ,而 DNP 的溶解则随之不断增加。当 NaCl 浓度大于 1mol/L 时 ,DNP 的溶解度最大 ,为纯水中溶解度的 2 倍 ,因此通常可用 1、 4mol/L NaCl 提取 DNA 。为了得到纯的 DNA 制品 ,可用适量的 RNase 处理提取液 , 以降解 DNA 中搀杂的 RNA 。
关于植物总 DNA 的提取主要有两种方法 :
1. CTAB 法 :
CTAB( 十六 烷基三***溴化铵 ,hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称 CTAB): 就是一种阳离子去污剂 ,可溶解细胞膜 ,它能与核酸形成复合物 ,在高盐溶液中(0、7mol/LNaCl) 就是可溶的 ,当降低溶液盐的浓度到一定程度 (0、3 mol/L NaCl) 时从溶液中沉淀 ,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开 ,然后
CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中 ,再加入乙醇使核酸沉淀 ,CTAB 能溶解于乙醇中。
2. SDS 法 :
利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS(十二烷基磺酸钠 ,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA 与蛋白质分离 ,在高温 (55～65℃) 条件下裂解细胞 ,使染色体离析 ,蛋白
变性 ,释放出核酸 ,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀 , 离心后除去沉淀 ,上清液中的 DNA 用酚 /***仿抽提 ,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA 。一般生物体的基因组 DNA 为107~109bp,在基因克隆工作中 ,通常要求制备的大分子 DNA 的分子量为克隆片段长度的 4 倍以上 ,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端 ,导致酶切后有效末端太少 ,可用于克隆的比例太低 ,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子 DNA 的方法必须考虑两个原则 :(1)尽量去除蛋白质、 RNA 、次生代谢物质 (如多酚、类黄***等 )、多糖等杂质 ,并防止与抑制内源 DNase 对 DNA 的降解。 (2)尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切