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华中科技大学
博士学位论文
NK细胞通过clathrin途径回收穿孔素及对杀伤功能的影响
姓名:汪蕾
申请学位级别:博士
专业:免疫学
指导教师:龚非力;郑芳
2011-05
华中科技大学博士学位论文

中文摘要

NK 细胞通过 clathrin 途径回收穿孔素及对杀伤功能的影响

博士研究生: 汪蕾
导师: 龚非力教授、郑芳副教授
华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学教研室
一、前言
自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell)是固有免疫系统的重要组分,其
通过释放胞毒效应分子(穿孔素、颗粒酶等)而杀伤畸变的自身细胞及感染病原
体的靶细胞。NK 细胞无需致敏即能直接杀伤靶细胞,并可连续杀伤多个靶细胞。
目前尚不清楚,NK 细胞每次杀伤过程中所释放胞毒效应分子的量,及其连续杀
伤过程中通过何种机制不断补充自身“弹药库”以维持“战斗力”。理论上,NK
细胞可不断合成新的效应分子,但该过程涉及效应分子的糖基化修饰、剪切、构
象改变,最后进入分泌性溶酶体,全程需数小时。因此,探讨 NK 细胞持续性杀
伤过程中合成和储备胞毒效应分子的确切机制,有助于从新的角度阐明 NK 细胞
杀伤功能的机制。
免疫突触与神经突触有诸多相似之处。文献报道,神经突触胞吐后可发生有
效的补偿性内吞,此对于维持突触功能具有重要意义。神经突触内分泌性囊泡与
细胞膜融合后,包括膜蛋白的多种分子可迅速回收至神经细胞内,其生物学意义
为:减少胞吐所致细胞膜表面积增大;回收的膜蛋白可参与形成新的分泌囊泡,
从而有利于神经突触适应不断发放的神经冲动。除膜蛋白外,神经细胞还可回收
可溶性神经递质。近年文献(包括本课题组前期研究)报道,免疫突触中存在双
向运输的载体,也具有回收存储胞毒效应分子的分泌性溶酶体膜蛋白的能力。深
入探讨胞毒效应分子的回收作用,有助于揭示细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T
lymphocyte,CTL)和 NK 细胞持续性杀伤作用的机制。
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穿孔素是一类重要的胞毒效应分子,在 NK 细胞杀伤靶细胞过程中发挥重要
作用,本文拟在课题组前期研究基础上,探讨 NK 细胞回收穿孔素的作用,并阐
明其机制及生物学意义。

二、NK92 细胞受靶细胞刺激后可继发性内吞释放的穿孔素
早期内体是细胞回收细胞外物质的最初细胞器,早期内体体积增大提示外源
性物质的进入。本实验用荧光标记的转铁蛋白作为示踪分子,观察其被 NK92 细
胞内吞后的定位。转铁蛋白内吞后进入早期内体,导致后者体积显著增大,可作
为细胞发生内吞的指标。此外,与早期内体共定位也表明内吞的分子已进入早期
内体。
通过观察 NK92 细胞早期内体,判断 NK92 细胞被靶细胞刺激后是否发生胞
吞,结果发现:NK92 细胞受靶细胞刺激 15 分钟后,其早期内体比对照组明显
增大,提示 NK92 细胞发生内吞。
乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic
acid,EGTA]可抑制 NK92 细胞胞吐,但并不影响 NK92 细胞与靶细胞间形成免
疫突触。为探讨内吞发生的时相,我们在 NK92 细胞与靶细胞接触过程中加入
EGTA,发现可显著抑制早期内体增大。提示 NK 细胞内吞继发性于胞吐之后。
我们还发现,靶细胞刺激 NK92 细胞 15 分钟,穿孔素与早期内体出现明显
共定位现象,而未受刺激的 NK92 细胞无此现象。另外,加入 EGTA 同样可抑制
穿孔素与早期内体共定位。上述结果表明,NK92 细胞杀伤靶细胞过程中出现穿
孔素内吞,该效应继发于胞吐。

三、NK92 细胞通过 clathrin 途径回收穿孔素
首先应用放线菌酮抑制新蛋白质合成,以避免新生成的穿孔素干扰实验结
果。继而应用针对不同胞吞途径的抑制剂,探讨 NK92 细胞内吞作用的机制。结
果发现:应用针对 clathrin 途径的抑制剂后,受靶细胞刺激的 NK92 细胞内其穿
孔素水平明显降低(与未用抑制剂的 NK92 细胞相比);应用针对脂筏和胞饮途
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径的抑制剂并不影响胞内穿孔素水平。提示:穿孔素内吞效应为 clathrin 途径依
赖性,脂筏和胞饮途径介导的内吞不参与穿孔素回收。
借助共聚焦显微镜进一步证实穿孔素循 clathrin 内吞途径被回收,结果发现:
在针对 clathrin 内吞途径的化