限制性内切酶酶切位点保护碱基.doc

寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。实验方法:用γ-[ 32P]ATP 在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与 20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和 20小时。反应缓冲液含 70mMTris-HCl (pH ), 10mMMgCl 2,5 mMDTT 及适量的 NaCl 或KCl (视酶的具体要求而定)。 20% 的PAGE (7M尿素) 凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 DNA 合成,新链的延伸方向是 5→3 因此,需要在 5 端加上酶切位点, 因为内切酶除了有特异的识别位点之外,还需多几个无需特异性的碱基提供一个 platform 让它可以结合上去, 否则会掉下来. 引物的结构就是( 5→3) :保护碱基+ 酶切位点+ 原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点,只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次,如果需要做表达,需要考虑起始密码子,防止移码突变酶寡核苷酸序列链长切割率% 2 hr 20 hr Acc I G GTCGAC C CG GTCGAC G GTCGAC CGG 8 10 12 000 000 Afl III C ACATGT ACATGT GG 8 10 0 >90 0 >C ACATGT GGG 12 >90 >90 Asc I A T TT AA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Ava I CGGG CCCGGG GG CGGG GGA 8 10 12 50 >90 >90 >90 >90 >90 BamH I C G CG CG CGC GCG 8 10 12 10 >90 >90 25 >90 >90 Bgl II C AGATCT G GA AGATCT TC GGA AGATCT TCC 8 10 12 0 75 25 0 >90 >90 BssH II G GCGCGC C AG GCGCGC CT TTG GCGCGC CAA 8 10 12 00 50 00 >90 BstE II G GGT(A/T)ACC C90 10 BstX I AATGCATTGG AATGCATTGG AA AATGCATTGG ATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 >90 Cla I C ATCGAT G G ATCGAT ATCGAT C ATCGAT GGG 88 10 12 00 >90 50 00 >90 50 EcoR I G GAATTC C CG GAATTC G GAATTC CGG 8 10 12 >90 >90 >