钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧性损伤中的作用及其细胞内机理研究.pdf

四川大学
博士学位论文
钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧性损伤中的作用及其细
胞内机理研究
姓名:周晖
申请学位级别:博士
专业:儿科学
指导教师:毛萌
20060401
声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的,论文成果归四川大学所有,特此声明。申请人指导教师
哪缩略词表∞..英文缩略词英文全称中文全称话被啧甲基徇蛲脑源性神经营养因子钙调蛋白依赖性激酶反应元件一结合蛋白二甲基亚砜二硫苏糖醇细胞外信号胎牛血清胶质细丝酸性蛋白汉克平衡盐溶液∞牛血清白蛋白调节激酶羟乙基呱嗪一乙磺酸即早基因’。.●
蛋白激酶咖舯英文缩略词中文全称英文全称┒思っ偷缪姑舾行钙离子通道乳酸脱氢酶丝裂原激活的蛋白激酶·一二甲基噻唑一一交倪虻_蜾逖甲基一天门冬氨酸光密度磷酸盐缓冲液十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳撼逖稳芤四甲基乙二胺酪氨酸蛋白激酶三羟甲基氨基甲烷千道尔顿·狝琕疉琋,疦’四川大学博士论文甈’耵.’
钙及钙调蛋白依赖性激酶在缺氧性神经元损伤中的作用及其机理研究中文摘要第一部分胚鼠大脑皮质神经元的体外培养、鉴定及神经元缺氧模型的建立与评价目的:建立胚鼠脑皮质神经元培养体系和建立神经元缺氧培养模型,方法:并对神经元缺氧模型进行形态学评价。牧寄壳氨还惴菏褂玫姆椒ǎ扇×:鲜褂.%胰酶及袢∩窬5ハ赴海约尤%%胎牛血清,作为接种及维持培养基,接种小时加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,综合使用上述方法建立体外神经元培养体系;タ寺】固灞昙巧窬#珿嗫寺】固灞昙切型胶质细胞,运用免疫荧光技术检测胚鼠脑皮质神经元纯度:用国产厌氧培养箱充入%、、%混合气建立胚鼠脑皮质神经元的缺氧模型;怪孟嗖钕晕⒕迪鹿鄄烊毖醪煌钡胚鼠脑皮质神经元,对神经元缺氧模型进行形态学评价./;腘褂肨四川大学博士论文
第二部分钙信号通路在缺氧性损伤中的作用结果:结论;目的;探讨钙信号系统在缺氧性脑损伤中的作用及与抗缺氧性损方法:分别采用阻滞剂尼莫地平、受体阻滞剂一:鲜褂.%胰酶及/呤蟠竽云ぶ剩褂加入%胎牛血清,腘作为接种及维持培养基,接种小时后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,可获取纯度在%以上的胚鼠脑皮质神经元;.培养的胚鼠皮质神经元的纯度ィ切徒褐氏赴恼慈韭%;怪孟嗖钕晕⒕倒鄄煜允驹谌毖小时后,神经元胞浆内开始出现空泡,折光性减弱;缺氧∈焙螅赴逯逅酰浆中空泡明显,部分细胞可见崩解现象;缺氧小时,大部分细胞轮廓模糊,胞体固缩成团,出现明显的核碎裂与核溶解;缺氧小时,细胞崩解现象加剧;缺氧小时,细胞及其突起几乎完全崩解消失。晒⒘烁叽慷壬窬L逋馀嘌逑担使用国产厌氧培养箱充入%骸%旌掀沙晒立胚鼠脑皮质神经元的缺氧模型;逋馀嘌鳲一∈笔巧窬6匀毖踝钗C舾械氖奔洌伤间的关系。四川大学博士论文、.
第三部分神经元缺氧性损伤中细胞内游离钙浓度的波动结果:结论:目的:,并采用胍Ⅱ阻滞剂,使用ḿ癓法检测细胞活性,对比单纯缺氧组,各种钙拮抗剂千预组,,的作用不肯定,联合使用一癈橄赴活性反而较单纯缺氧组低。髦肿柚图粮稍ぷ橛胱柚图组比较,细胞活性无显著性差别,各种阻滞剂稍ぷ橛隑稍ぷ橄赴钚晕尴灾圆钜欤菩藕畔低巢斡肓松窬5娜毖跣运鹕耍甃ǖ兰癗芴蹇赡苁瞧舳毖跣陨窬K鹕说闹饕8菩号通道,通道不起主要作用,参与了神经元的缺氧性损伤。ü齃芴澹珹芴褰榈嫉母颇诹骺赡懿皇荁轻神经元缺氧损伤的主要信号通路。拮抗四川大学博士论文’‘.
方法:以作为钙荧光探针,采用激光共聚焦显微镜扫描的结果:第四部分钙信号通路在缺氧神经元损伤中的机理研究结论:⒎撬嫒毖跏奔溲映こ上咝卧龀ぃ谌毖小时达顶峰,缺氧时间延长后,细胞内钙离子浓度反而降低;瓸稍ぷ橄赴诟评胱拥呐ǘ冉系ゴ咳毖踝楦撸崮5仄礁稍ぷ榧绊鲆干预组出现了明显的钙振荡;崮5仄娇啥唐谘杆俳档腿毖跎窬5南赴诟疲嫒毖跏奔的延长,细胞内钙仍可达到很高的水平;干预组可长时间降低缺氧神经元的细胞内钙,,一珻匀毖跎窬1;ぷ饔玫囊桓鲋匾T颍甂陨窬5谋;ぷ饔貌皇羌跎俑瞥亍目的:探讨参与缺氧性脑损伤主要的钙信号