基于转基因斑马鱼抗血管生成中药活性成分筛选及作用机制研究.pdf

●基于转基因斑马鱼抗血管生成中药活性成分筛选及其作用机制研究课题来源:广州市白云区科技计划年广州学位申请人所在学院刘晓伟教授导师姓名专业名称培养类型培养层次中西医结合临床科学型硕士研究生南方医科大学级硕士学位论文郑浩江中医药学院襫一●●●
基于转基因斑马鱼抗血管生成中药活性成分筛选及其作用机制研究硕士研究生:郑浩江指导老师:刘晓伟许文学摘要课题背景:随着社会经济的发展和生活水平的提高,疾病谱也发生了改变。感染性疾病负担减轻,而包括恶性肿瘤在内的慢性非感染性疾病和伤害逐渐成为发达国的是恶性肿瘤,恶性肿瘤已成为严重威胁我国居民健康的疾病之一。疗效欠佳,预后差且价格昂贵。因此,研制开发防治肿瘤的药物已成为当今医血管生成的方式发生的,若能够抑制肿瘤组织的血管生成,切断肿瘤的营养供饿疗法芸毂惶岢霾⒊晌R恢种瘟浦琢龅男路椒ā=昀矗恍┨逋庋芯渴家和发展中中心所提供资料显示:我国恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年增加,我国城市居民主要疾病死亡率位居首位目前,手术、化疗、放疗是临床上治疗肿瘤的基本方法,但副作用严重,学界的热点问题。随着对肿瘤研究的深入,发现原发肿瘤的生长和肿瘤细胞的转移均依赖于新生血管的长入,来为肿瘤的增长提供充足的营养。肿瘤新生血管的形成是以应,势必可以达到抑制肿瘤生长和转移的目的,因此,“抗血管生成疗法’’或“饥验均显示,抑制肿瘤细胞新生血管的形成,可达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。年伎寡9苌梢┪锉捶サタ梗糜谥瘟平嶂背Π捎行У难映病人的生存期。这些研究均证实抗血管生疗法治疗肿瘤的科学性和有效性。硕士学位论文
血管生成是一个受众多生长因子调节的复杂的生理、病理过程,在这些生瘤血管的作用,都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的,所以,及其受体是研究血管生成抑制剂作用机制的基本靶点。中医中药治疗疾病ㄖ琢有上千年的历史,积累了丰富的临床资料,近年来,斑马鱼因具有养殖和繁殖容易、胚胎发育迅速等生物学特点,逐渐被用于筛选抗血管生成药物,其具有以下独特的优势:①高通量喽杂谄他体内试验⒉僮骷虻ァ"谏秆≈芷诙獭0呗碛愕呐咛シ⒂俣瓤欤观察其活体状态下器官发育、血管生成情况。④样品用量少,且为活体动物实验。⑤用药简单。待测化合物可以直接溶于水中并扩散到胚胎中,也可直接注射到胚胎。⑥与人类具有高度相关性,筛选准确率高。⑦成本低。斑马鱼的饲⑶噍镧ァ⒌逵窈炀哂锌寡9苌傻淖饔谩U庑┲幸┗钚猿煞殖呗碛隳P外在其它模型上证实有抗血管生成作用,考虑到在斑马鱼模型上其发生抗血管生成效果的可能性更大,因此选用了这六种中药活性成分。本研究以转基因斑实验方法:长因子中,是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子,它能够增加血管通透性,促进肿瘤血管形成,对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移发挥重要作用,以及其受体作用途径中的任一环节为靶点,阻断对肿而且我国中药资源广博,因此,从天然药物尤其是传统中药中寻找安全有效的肿瘤血管生成抑制剂是新药研发领域的重要课题和全新方向。时即可得到试验结果。③胚胎透明、易观察。斑马鱼的胚胎是透明的,很容易养、繁殖成本远低于其他实验动物。近年来有研究表明:人参皂苷⒔;扑亍⑷ゼ装唑亍Ⅳ腔旎ɑ粕马鱼胚胎为动物模型,利用体视荧光显微镜观察中药活性成分对其体节间血管生成抑制效果,从分子生物学角度初步研究抗血管生成机制,同时为斑马鱼抗血管生成中药活性成分筛选的适用性和可行性提供实验依据。摘要
,。筛选前一天,挑选:转基因斑马鱼纯合子和野生型斑马鱼放于交配盒中,第二天早晨光照刺激产卵,收集半小时内的胚胎放于盛有胚胎培养液的培养皿中,、中、低个三个浓度。选择初步有抑制血管生成效果的药液及其浓度,每种药液浓度平行隹字馗词笛椤S谕慌嘌逯校舫列孔,屑马鱼胚胎相比大体形态发育正常;荧光分布紊乱等荧光表达异常的胚胎。达规律,实验设计分处理组和空白对照组,收集呗碛闩咛方法同前治龊螅舴讲畈黄耄褂媒艶检验的和瓼ǎ缓笤擞没诜讲畈黄氲亩嘀乇冉戏椒―痶⒀∮么醒9苣谄は赴蛘咂淝疤逑赴奶匾煨员昙俏飂淖;虬培养。当胚胎发育至弊R浦潦⒂信咛ヅ嘌旱装逯校扛隹追湃个胚胎备用。胚胎发育至保渲煤玫囊┮阂来渭尤装逯小C阳性对照药物,胁挥杓右列组。中药活性成分均用二甲基亚砜溶解。胚胎发育至肙迨接ü显微镜观察。挑选抗血管生成有效中药的胚胎指标如下:与同时期野生型斑刀『基因荧光表达强度减弱、缺失或者血管⒄攵陨秆∮行У哪勘甑ヌ澹谐醪交蒲芯俊J紫壤谜逶辉咏的方法,初步预测ㄐ其的表达情况,实验设计分正常组和试验组,收集呗碛闩咛方法同前迨佑ü庀晕⒕倒鄄炫恼铡镉%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,凝胶成像系统捕获图像,利用软件获得具体数据。⑹笛槭萦镁⒈曜疾畋硎尽6喔鲅揪涞谋冉嫌玫ヒ蛩胤讲罘析。使用甒