聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究.pdf

山东大学
博士学位论文
聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究
姓名:李凡
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:陈冠军;刘巍峰
20080410
缩略词表山东大学博士学位论文
论文作者签名:二纽导师签名:卫簋鲰日期:量煎:合原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。C苈畚脑诮饷芎笥ψ袷卮斯娑全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名:
耕卜摘要胶、蚕丝、蛋白胨等部梢愿咝У挠盏糚降解酶的产生,推测降解酶与蛋石油基塑料作为材料产业的一大支柱,已经成为社会生活不可或缺的一部分,但随着白色污染的严藿及石油资源的日益匮乏,其地位明显动摇,绿色高分子材料逐步受到青睐。目前开发的绿色高分子材料主要是聚酯类,其优势体现在具有生物可降解性和可再生性;而且,天然的或经过改性的聚酯具有和传统塑料相当甚至更优的机械性能和物理化学性能,能够满足人们社会生活的需求,其中聚乳酸云溆帕嫉奈锢砘阅芎颓痹诘某杀居攀朴仁苋嗣堑墓刈ⅰD前相对于其它高分子材料,丫云湫阅芎统杀居攀坡氏仁迪至舜蠊婺5牟业化生产,成功地应用予医疗、统织和包装等产业,被认为是簸具潜力的替代现有塑料的新型“生态材料”之一。虽然谛阅芎蜕τ蒙嫌肫渌埘ハ啾染哂忻飨缘挠攀疲灯渖锝解的研究却相对滞后。谧匀唤缰薪到饣郝⑾值慕到馕⑸锖透咝Ы到酶有一定的特殊性,这限制了针对掀锎砘厥障低车目7ⅲ雒挥谐晒的回收系统将无法实现奈锪涎贰D壳癙的降解机理尚未阐明,这在缀大程度上限翩了可控降解材料的开发,也限制了谋绲耐乒愫陀τ茫有强化目焖俳到庑院屯耆ń到庑曰淼难芯浚拍芄徽孚┦迪制浠肪秤押化。因此,本文从到饩旮叻ⅲ芯苛薖乙钓C傅男灾始按叽刻匦裕酶催化机理及进化分析的角度对慕到饣平辛颂教帧1疚闹饕5墓ぷ髂容及缨梁如下:窆酝寥姥泛途挚饩值纳秆。竦昧艘恢旮咝Ы到釶的菌自然界中降解木晔钟邢蓿饕<性谙∮蟹畔哂┲小1疚耐ü土壤和菌种库的筛选获得了对哂薪到庾饔玫木辏⒁云渲薪到饽芰ο对高效的为研究对象,进行了降解性能的评价和表征,证实该菌株可以以Nㄒ惶荚唇猩ぃ战到獠锶樗帷S盏际笛榻果显示该菌株分泌产生诱导型的到饷福薖以外,蛋白类物质山东大学博士学位论义。
这些降解酶对慕到饣钚跃萈的代表性降裤酶一蛋白酶8摺3覣发酵液中同时分离到了三种对哂懈咝媒到饷干畔⒖寺〉搅礁鯬降解酶基因,并初步实现了其异源表达。果设计引物,┰霾糠只蛐蛄校缓笸ü恢中滦说娜旧宀揭萍际跻一—锹∪ǔせ颍竦昧肆礁鼋到饷窹蚉的基因序蛄斜榷约巴茨=ń沂玖薖降解酶结构的特殊性。白酶类存在着一定的相关性。通过比较,确定选择明胶为最健诱导物进行下一步的诱导产酶。降解器用的降解酶。目前国际上报道的从聚乳酸降解菌株中分离得到的降解酶只有觯⑶揖为单酶组分。本文首次利用离予交换、蔬水层析、分子簿层桥等分离方法从发酵液中分离到了三种对哂懈咝Ы到庾饔玫慕到酶,并对其催化特性进行了系统的研究。<钚缘鞍住;钚员冉霞岸ρР问治龆枷允境了对哂薪到庾饔靡酝猓庑㏄降解酶对蛋白及小肽类物质也都具有降解活性,显受丝氨酸蛋囱酶抑制荆的强烈抑制,铁催纯特性上分析该酶可能属于丝氨酸蛋白酶。甌肽指纹图谱分析结果显示,三个降解酶的胰酶酶解峰各不搁弱,可麓不是来源于露一前体,面是独立的降艇酶组分;质谱结果的数据库比对没有找到匹配程度较高的鬣白,暗示这些降解酶可能是没有经过系统磺究的薪的酶类。羁前仅有两篇文章报道了到饷富虻南喙匦畔ⅲJ峭ü蜃文库遴行功能筛选获得其基因,另~篇是通过对降解酶进行有限酶解后测序设计相应探针从基因组文库中获取相关基因。本文根据降解酶具有丝氨酸蛋白酶的生化性质,推测其具有保守的丝氨酸位点,根据保守位点序列及酶的瞬庑蚪列;同时,将到饷富蚍直鹪诖蟪Ω司翱莞镅挎吒司薪辛吮泶铮获得了具有活饿的重组表达蛋白,初步建立了到饷傅谋泶锾逑担佣深入精细地研究其功能机制奠定了基础。山东大学博士学位论文
通过网.’卜数据库及一系列生物信息学软件对降解酶的结构进行了分析。结果显示,蚉属于丝氨酸蛋白酶家族的亲澹哂兴堪彼岬白酶的保守结构域,三联体活性中心并未发生明显变化,分别对应于的蚉的、;而且其整体结构也和蛋白酶家族中的其它酶一样具有两个桶结构域,活性中心处于两个桶