尼帕病毒荧光rt-pcr检测方法的建立.pdf

扬州大学硕士学位论文符号说明 amplicilin 氨苄青霉素 basepair 碱基对 Threshold cycle 循环闺值 copy per reaction 拷贝,plementary DNA 互补DNA dicthylpyrocarbonate 焦碳酸二乙醣 Deoxyribonuclease 脱氧核耱核酸酶 Deoxy-nuclcotide U'iphosphate 脱氧核苷三磷酸 enzyme linked immuneosorbent assay 酶联免疫吸附试验 6-carboxyfluorescein 6-羧基荧光紊 Immunohistochemistry 免疫组化 IsopropyI-D-thiogalactosidc 异丙基硫代半乳耱基 Minute 分钟 Milliliter 毫升 Nipah Vh-vs 尼帕病毒 Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 Ribonucleic Acid 核糖核酸 ribonuclca∞H 核糖核酸酶H rotationper minute 转/分 RgvcPJe transcr幻t 反转录 OfficeInternational desEpizooties 世界动物卫生组织 6-carboxytetramelhylrhodamine 6-羧基四甲基若丹明 Microgram 微克 Microliter 微升 5--3一indolyl-p- 5一溴一4一氯一3川I哚巾--D--半乳糖 6 罟e止~ 郭丽霞:尼帕病毒荧光RT-(Nipah Virus,NiV)是1999年新发现的一种烈性人畜共患病, 可引起猪的呼吸道症状和人的急性致死性脑炎,首次发现于马来西亚。NiV与1994 年在澳大利亚首次发现的人畜共患病病毒——亨德拉病毒(Hendra Virus,HeV) 极为相似。NiV与HeV均为副黏病毒科亨尼病毒属成员,虽然只在局部地区暴发, 但是它具有很宽的宿主范围,%,已成为全球关注的公共卫生问题。虽然我国尚未发现尼帕病,但该病在我国邻近国家,如孟加拉国、印度,频频发生,并且我国西南和华南一带存在大量的此病毒储存宿主——果蝠, 因此此病毒对我国构成了巨大威胁。为防范该病传入我国的风险,本研究建立了此病毒荧光RT-PCR检测技术,以期快速检测NiV,并用该方法检测了一些临床样品。根据GenBank中发表的马来西亚、孟加拉国和印度等国报道的NiV的N基因序列,通过分析比较在其保守区域设计了两对引物和探针,分别对应两套检测体系,筛选出灵敏性和特异性都比较好的一套检测体系。针对类似检测方法中RNA阳性对照易降解等问题,本研究设计并合成了选定体系的阳性对照序列。该阳性对照序列含有相应引物的结合位点,但两引物之间的阳性对照的一些碱基被去除掉,人工合成此DNA序列后克隆到pBSK质粒,构成重组质粒pBSK-NiV-P,用第一套引物扩增, 载体,然后用上下游均含有T7启动子的PUC引物扩增,扩增产物纯化后用T7转录酶系统进行体外转录。体外转录产物本质上是dsRNA,它经适当倍数的稀释后, 用作上述荧光RT-PCR的阳性对照。,并分别用DNase、RNase I消化等方法检验其稳定性,~,纯度较高,经3TC温育 24h和RNase I作用lh后仅有微量降解,说明其性质稳定。对反应条件进一步优化后,该方法还可以用于SYBR GreenI模式和普通RT-PCR检测。对梯度稀释的 RNA和cDNA的检测可知建立的荧光RT-PCR对RNA的检测达到140拷贝/体系, 扬州大学硕士学位论文 2 对eDNA的检测达到17拷贝/体系,敏感性比普通RT-PCR高100倍。从大肠杆菌、Veto细胞及猪各脏器中提取总RNA,用该荧光RT-PCR方法及阳性对照进行检测,结果全为阴性,表明该方法特异性很好。其中有36份猪的脏器来自2005年四川链球菌疫区的病猪,为当时疫病的准确诊断提供了重要参考。从海南采集31只果蝠的血清、咽拭、尿液及各脏器的组织样品。用Vero细胞进行病毒分离。用本研究建立的RT-PCR方法检测组织样品和细胞培养物中是否含有NiV;血清样品用本实验室建立的ELISA方法检测尼帕病毒特异性抗体。ELISA 结果与RT-PCR检测结果均为阴性,表明样品来源的果蝠携带或感染过Niv的可能性很小。关键词:尼帕病毒;荧光RT-PCR;阳性对照RNA