嗜热真菌热稳定纤维素酶分离纯化及基因克隆与表达.pdf

山东农业大学
博士学位论文
嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达
姓名:李亚玲
申请学位级别:博士
专业:植物病理学
指导教师:李多川
20070612
英文缩略词及中文对照表嗜热真菌熟稳定纤维豢酶的分离纯化及基因克隆与袁遮矗
导师签名:垃嚣期:丝论文作者签名:』爱参匆套关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所人或集体,均在文中明确说明。旧鞯姆稍鹑斡杀救顺械!文的全聱或蒸分内容编入有关数据痒进行裣索,爵以采用影露、缕印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。取德躲成果。对在论文研究袈离给予指导、帮韵昶傲爨重要嚣黻的个本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定,同意学校保爨积按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版,允许论文被查阅和借阅。.本人授权山东农业大学可以将本学位论保密论文在解密后应遵守此规定。
嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达中文摘要纤维素是地球上最丰富的碳水化合物质,可被纤维素酶降解转化成为葡萄糖。具有很好的开发前景。纤维素酶因其在多领域潜在的应用价值而倍受关注,它可用于纤维废物的生物转化,也可用于纺织、造纸、洗涤、饲料加工等工业领域,还可用于加工单细胞蛋白,制备酵母和丝状真菌的原生质体,进行菌株改良。传统上采用化学方法控制纤维素降解难度大、成本高,对环境污染严重,而纤维素的生物降解有效克服了这些问题,不但提高了资源利用效率,而且增加了经济效益。纤维素能被千百种真菌、细菌和放线菌等微生物所降解,生物降解过程很重要的一组酶是纤维素酶。外切葡聚糖纤维二糖水解酶,猤!疽羖,猤,.是其中必不可少的一类酶。在水解纤维素过程中,外切葡聚糖纤维二糖水解酶主要作用于纤维素线性分子非还原末端,,每次切下一个纤维二糖分子,使结晶纤维素成为易溶解的非结晶纤维素。肛葡聚糖苷酶鵯,.虺艬也是纤维素酶系的重要组成成分,这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子防止纤维二糖的积聚,减轻其对纤维素酶的抑制作用,因此该酶对于纤维素酶系的整体水解活性有很强的促进作用。嗜热真菌产生的纤维素酶在高温条件下具有高活力和稳定性,并且与中温真菌一样,嗜热真菌产生的各类纤维素酶普遍含有多种类型的组分。到目前为止,外切葡聚塘纤维二糖水解酶和黄咸烟擒彰冈谡婢系难芯咳远嘁灾形抡婢V鳎热日婢上的研究很少。本实验室分离的嗜热毛壳菌和埃默森篮状菌是广泛分布的,生长上限温度较高的两种嗜热真菌,从这两种菌中均已分离了多种嗜热纤维素酶,主要是内切葡聚糖酶和黄咸烟擒彰浮1狙芯吭诜⒔凸讨屑觳獾酵馇衅暇厶窍宋撬饷傅幕性,说明嗜热毛壳菌和埃默森篮状菌是纤维素酶系较齐全的两种嗜热真菌。本研究中谝晕⒕宋匚Nㄒ惶荚吹暮铣膳嘌幸禾逵盏挤⒔筒外纤维素§髟通过硫酸铵沉淀、—趵胱硬阄觥肿由覆山东农业大学博士学位论文
耆肯馕.,鼹℃爨下瓣珏衙厝蓔酶基本鄂是稳定兹,在∞℃嚣謇蛔蘾矗嚣,氆麓煞裁余约℃,反瘦弱最逶蠼壤在,θ蟆t飠豹岛凳/#堕整壅塑垫整塞篓缝鲞壁塑坌童垫垡墨墨望塞璧皇墨整析、强阴辫子层析等步骤获得了两种凝胶电泳均~的外切葡聚耱纤维:糖承解酶帮~耱参蘩萄糖蛰酶,同爨瓣该两静酶夔多项理纯性震送行磁究。甈痰盟掷氪炕馇衅舷筇窍宋撬饷傅鞍椎姆肿恿吭嘉8昧街置阜赐淖钍饰露确直鹞。反应的最适值分别为褒。在∞℃鞋下蘧耱酶臻毙较稳定,在℃绦瀑氇嚣酶涎馁仍维持在%左右,,在下保温的活性。相比较而言,鼹有比叩娜任榷ㄐ浴U饬街置溉任榷ㄐ越现形抡婢豹弱类赘鬻。这嚣秘酶农,渍槠墙衔榷ǎ稻舷鐌饶蘩聚耱纾缝二耱瘩孵酶廷蚓哂幸欢ǖ哪退嵝浴R詐5孜顲腒滴.。纯化的伊葡萄糖苷酶为单亚基蛋融,相对分予爨在浞从Φ囊墒饰露任躜衩蹑讼卤7⒉竟鲐靡分离两种外切葡聚糖纤维二糖水解酶,其中.。其最适反应温度分别为和,最遗反应值为和T婕酶活还能保持在%发右,其热稳定性较好。冈趐..浣衔N榷ǎ趐。之间的范围内比较稳定,该酶较之哂泻芮康哪退嵝浴R秀底纺,根据舆菌外切葡聚糖纤维二耱水解酶的氨基黻同源保守序列设计简并引物,通过及快速扩增末端的方法,克熙了嗜热毛壳麓熟稳定绎绫二耱承解酶基因,序列全长为,包禽一个拜救凝读搓,编码霭被帷8没蛞言贕中注册,登录号为。同时提取嗜热毛壳菌蜃镈,克隆了该外切酶的部分蛄校窳痰男列长,包含三个内含子区域。该基因在米晷肺狤盖泻螅逋饬庸菇了酵母分泌篷表达载俘/,将重组表达溪筏/和空质粒分剐用限制性内切酶位于疉线性纯后,浆爝龟击法转戴巴斯德毕赤酵母惺芴赴贛疢桨迳仙秆绲慕湍转化予。续道癫饧癎菇ろ把《嗫奖凑嵊瑁托信树跤盏寂嘌e怨觳各转化子帮隔牡按驯泶锴榭霾缮秆「咝П泶锩氐南宋撬饷副9ゐⅣ逯辍>过检测与筛选获得了转酵母工程菌株,检测目的蛋囱的表达量及遗传稳定性,并测定表哂サ幕钚裕嫦卤N杂哂薪虲的分子量约为