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半纤维素酶基因的克隆与表达

(深圳大学,生命科学学院,二 000 级生物技术张超)
(学号:2000302023)

摘要:本工作的目的是对里氏木霉的半纤维素酶基因进行克隆,再利用毕赤酵母完
成基因的表达。由于半纤维素酶在纸浆预漂白,速溶咖啡的生产,饲料生产等方面都具有重
要作用,因此本工作对造纸业和食品工业都具有非常重要的意义。这个实验大致操作方法是:
首先设计合适的引物,通过 PCR 技术从里氏木霉基因组中扩增出基因 xynl,把基因与大肠
杆菌质粒(PPICZA)相连接,再把重组的质粒转入到感受态 Top10 大肠杆菌中,待 Top10
大肠杆菌产生大量的重组质粒后,用中量制备质粒 DNA 方法把重组的质粒提取出来,再用
PCR 方法或双酶切方法检验重组质粒。得到的重组质粒线性化后通过电转移的方法把其转
入毕赤酵母表达系统中,通过同源重组,xynl 接入到毕赤酵母基因组中。最后通过重组毕赤
酵母的发酵表达出半纤维素酶。实验结果显示,我们已经得到含有重组质粒的大肠杆菌菌落,
基本上完成了基因 xynl 的克隆。并且,经电转化后的重组毕赤酵母也表达了所需片断大小
的蛋白。
关键词:里氏木霉,半纤维素酶,毕赤酵母
教师点评:半纤维素酶在酶法制浆,饲料添加剂,以及木质纤维素资源的综合利用等方
面具有重要的应用。该论文目的在于使用毕赤酵母表达系统表达 xynl,选题具有一定的社会
经济意义。通过 PCR 方法已成功从里氏木霉的基因组 DNA 扩增出基因 xynl,通过合适的
载体和电转化技术使基因 xynl 的插入到毕赤酵母的染色体中,并使基因 xynl 处于毕赤酵母
强启动子(Aox1)下游,初步进行了基因 xynl 的表达,取得了良好的实验效果。

前言
随着人口的不断增长和资源的进一步消耗,可再生资源的开发利用已经成为人们共同关
注的问题。在植物的光合产物中,半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类碳水化合物,如秸
秆中半纤维素的含量占其干重的 25%~50%[1]。除了其数量之大,半纤维素成为可再生资源
的另一个因素是它比植物中的其它组分更易于提取和水解。如果人们能够使纤维素和半纤维
素得到充分降解和有效转化,2kg秸秆就可以充当 。纤维素的结构及其降解
过程相对简单一些,因此,半纤维素开发利用成为关键问题,它的解决对人类有不可估量的效
益。
半纤维素酶可将木质纤维性材料转化为可发酵糖或其他有用物质。酶法水解半纤维素还
可得到各种低聚糖,这些低聚糖作为动能性食品越来越受到人们的重视。此外半纤维素酶还
广泛适应用于食品和饲料工业中,半纤维素酶与果胶酶和纤维素酶一起可用于水果、蔬菜的
浸软及果汁(酒)的澄清[2]。在改善烘烤食品的质地、结构,提高咖啡和植物油浸出率以
及改善育贮饲料的营养价值等方面,半绊维素酶也都体现了广阔的应用前景。目前,应用半
纤维素的最广,最成功的领域是纸浆业。人们已能成功地应用半纤维素酶对牛皮纸浆进行预
漂白和获得高纯度纤维素浆,并尝试开拓酶法去皮和酶法脱墨等新应用领域[2]。木聚糖酶
在食品、饲料和造纸工业中的广泛应用开辟了半纤维素酶的应用新领域,尤其是酶法漂白用
于造纸工业是一项新技术,它的研究、开发和利用已引起行家的关注。国内在这方面的研究
才刚刚起步,相信在不久的将来,这项利于提高纸浆质量,同时又利于环保的新技术会得到
广泛应用。
本工作就是把里氏木酶的半纤维素基因 xynl 与载体相连,然后通过载体转入到毕赤酵
母中,通过对重组毕赤酵母的发酵,使重组毕赤酵母把半纤维素酶分泌到发酵液中。最后我
们把发酵液纯化后就可以方便而又大量的获得半纤维素酶,把其运用于各项工业当中。
第一章文献综述
半纤维素的组成及水解过程
植物是自然界主要的可再生有机资源,主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。半纤维
素占植物干重的 35%,在自然界中含量仅次于纤维素。与纤维素(β-1,4 葡聚糖主链)
相比,半纤维素结构与组成十分复杂,包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚
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糖和木葡聚糖等多种组分,而其中又以木聚糖和甘露聚糖两种多糖与食品、饲料及制浆造纸
工业关系最大,所以在此我们着重讨论与木聚糖和甘露聚糖有关的半纤维素和半纤维素酶,
木聚糖和甘露聚糖是含有不同糖残基的分支杂多糖。木材中的甘露聚糖都是由毗喃甘露聚糖
和毗喃葡萄糖通过β— 1,4 糖苷键交联而成的葡甘露聚糖,软木中的半纤维素主要是一些
含有乙酰取代基或半乳糖取代基的葡甘露聚糖[3]。许多植物种子中的半纤维素主要是半乳
甘露聚糖[4]。硬木中的半纤维素主要是木聚糖[2],木聚糖骨架主要