重组体的筛选与鉴定.ppt

重组体的筛选与鉴定
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第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
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转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组子。
如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子
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选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。
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根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
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转化率的影像因素
1. 载体DNA及DNA重组方面
载体自身性质，不同载体的转化效率不同
载体分子的空间构象（超螺旋与线性）
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理
感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌龄、***化钙处理时间（12~24h）感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
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遗传学选择法（genetic selection）：主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的方法。
抗药性、显色、营养缺陷等
2. 物理筛选方法：
3. 核酸杂交法
4. 表达产物分析法
筛选的两层含义：将携带有外源插入DN***段的克隆挑选出来，将携带有外源插入片段的重组体挑选出来
PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引
物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞克隆的DNA结构，以特定扩增DN***段的有无，鉴别
同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔‘〕。随
后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2基因进行了定点突变〔’〕；Zimmer等用PCR方法筛选
点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠
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一、抗药性标记及其插入失活选择法
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
第一节 载体表型选择法
1. 原理：
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pBR322
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（1）四环素：
（2）氨苄青霉素抗性基因：
2. pBR322抗菌素标记选择
含bla基因的菌体产生-内酰***酶，使氨苄青霉素转变为青霉***酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
（3）环丝氨酸：
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