柱层析实验报告.doc

柱层析实验报告
柱层析实验报告
柱层析实验报告
柱层析分离色素
一、【实验目的】
1。了解柱层析的分类,掌握各种柱层析的原理。
．
二、【实验原理】
叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素ｂ、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95％乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种,它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离．常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大,经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂(如氧化铝或硅胶),当混合物的溶液流经吸附柱时,就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同,因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附－解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分,并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中(压成柱状)作为吸附剂,将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上,色素即被吸附．由于色素的种类不同,被吸附的强弱不同,就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱,从而达到叶绿体主要的４种色素(叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素)的分离。
三、【实验材料】
原料:
新鲜的菠菜叶
试剂 ：
1． 无水乙醇或95%乙醇 　 　　 　　 　　　
2．　石英砂 　　 　 　 　 　 　 　 ６．饱和***化钠溶液
3. *** 　 　　 　　
4。 石油醚（６０—9０℃) 　 　　 　 　8洗脱液：***：石油醚＝1:9 器材 :
层析柱（1×30cm）,　　研钵， 蒸馏装置，
脱脂棉， 　天平， 烧杯, 　过滤漏斗，
玻璃棒, 锥形瓶，　 分液漏斗， 试管 ，
铁架台
四、【实验操作】
1. 色素的提取：
柱层析实验报告
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20克菠菜,加少许石英砂,再加20毫升无水乙醇研磨成浆,脱脂棉过滤,保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入３0毫升石油醚提取一次,过滤,合并滤液，转移至分液漏斗中，再加入40毫升饱和***化钠溶液震荡,弃去下层溶液，再分别加入2０毫升水震荡洗涤几次,直至下层无色，保留上层溶液,转移至三角瓶中,加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.
：
将提取液放入蒸馏烧瓶中,蒸除多余的石油醚,至剩余液体５－8毫
升左右,以备加样使用。
：
１５克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min。．在层
析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂０．5ｃm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内,倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，，顶部加一小团棉花,。
３．样品的分离层析:吸附层析分离色素
打开层析拄下部开关,向拄内加入２毫升浓缩液,至液体没入砂内,
再加入石油醚冲洗拄壁,液体浸入砂内,加洗脱液开始层析,可以看到不同色带如图片1,直至第一条色带洗脱完毕,在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液,如图片2。
五、【实验结果】
实验结果如下图：
图一:层析柱中出现黄色带
图二:提取出的黄色胡萝卜素
结果分析:
洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移,色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同,原因在于层析柱的制作过程并不完全均一,使层析柱内部不均匀,以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。
七、【注意事项】
１、萃取时不要剧烈振荡,以防止发生乳化现象.
２、为了保持柱子的均一性,使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时,就会使柱身干裂,影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。
3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸)是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉(或沙子）可以防止吸附剂细粒流出.
４、层析柱填装紧密与否,对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀,会影响渗透速度和显色的均匀。
６、洗脱流速不宜过快,避免因此压紧凝胶,色素分离不开;也不要过慢,使柱装得太松，导致层析过程中,凝胶床高度下降，色素洗脱很慢