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荧光原位杂交（FISH） Fluorescence in situ hybridization
FISH杂交技术 ppt课件
2021/3/26
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原位杂交（ISH）
原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。
使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。
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基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交，经放射自显影或非放射检测体系予以显示，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。
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原位杂交常用的标记物质
3H、35S、125I、32P等
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荧光素、生物素、***等
放射性同位素
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非放射性物质
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70年代
80年代中后期
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几种原位杂交技术
1 基因组原位杂交技术
2 荧光原位杂交技术
3 多彩色荧光原位杂交技术
4 原位PCR
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荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,它提供了将特定DN***段和特定的真核生物细胞的染色体区带联系起来的快速而有效的手段,是研究DNA序列在染色体上位置的最直接的方法,自问世以来就广泛应用于生物学研究中。它是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。
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FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。
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FISH发展
1974 年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。
1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生物素与RNA 分子连接起来。
1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
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20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
FISH发展
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FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。
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