还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.doc

还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.doc还原糖和总糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法
一、 目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使
用。
二、 原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。 还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类， 单糖都是
还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同， 可将植物样品中的单糖、 双糖和多糖分别提取出来， 对没有还原性的
双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定， 再分别求出样品中还原糖
和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物， 3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的
3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系， 利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值， 查对标准曲线并计算， 便可求出样品中还 原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时， 每断裂一个糖苷键需加入一分子水， 所以在计
算多糖含量时应乘以 。
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三、实验材料、主要仪器和试剂
实验材料
小麦面粉；精密pH试纸。
主要仪器
（1）具塞玻璃刻度试管：20mLX 11
大离心管：50mLX2
烧杯：lOOmlXl
(4 )三角瓶：1OOmLX1
(5 )容量瓶：100mLX3
刻度吸管：1mb 1; 2mb2; 10mLX1
恒温水浴锅
沸水浴
离心机
(10 )扭力天平
(11)分光光度计
试剂
1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80C烘至恒重的分析纯葡萄糖 1OOmg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后， 转移
到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 1OOmL混匀，4C冰箱中保存备用。
3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂
2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再
加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL,贮于棕色瓶中备
用。
碘-碘化钾溶液：称取 5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
酚酞指示剂：称取 ，溶于250mL703乙醇中。
6M HCl 和 6M NaOH各 100mL
四、操作步骤
制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，按表 1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水
和3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
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表1葡萄糖标准曲线制作
样品中还原糖和总糖的测定
还原糖的提取
，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50mL
蒸馏水，搅匀，置于 50C恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移 到50mL离心管中，于 4OOOr/min下离心5min,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将 二次离心的上清液收集在 100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度， 混匀，作为还原糖待测液。
总糖的水解和提取
，放入 100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCI，置沸水 浴中加热水解30min (水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却 后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中， 混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液 10mL,移入另一 100mL容量瓶中定容，混匀，作为
总糖待测液。
显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂， 空白调零可使用
制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
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