实验Folin酚试剂法测蛋白质含量课件.ppt

实验Folin酚试剂法测蛋白质含量
怎样测定血清中蛋白质含量
蛋白质含量测定常见方法比较
方 法
灵敏度
优点
缺点
凯氏定氮法
~
干扰少，准确
操作复杂，费时
紫外吸收法
50～100mg
快速简便
无损样品
灵敏度低
干扰物较多
考马斯亮蓝法
（Bradford）法
1～5ug
灵敏、简便、快速
不同蛋白质测定时有较大的偏差
双缩脲法
1～20mg
干扰相对少，较快
灵敏度低
Lowry法
20～250ug
灵敏度高
干扰物质多、费时、操作严格计时
选择测定方法时应考虑
1、试验对测定所要求灵敏度和正确度;
2、蛋白质性质;
3、溶液中存在干扰物质;
4、测定所花费时间等。
Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
试验目
1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量原理
及其试验操作技术。
2、掌握制作标准曲线要领和经过标准曲线
求样品溶液中待测定物质含量方法 。
原理
1921年, Folin 首创, 利用蛋白质分子中酪氨酸
和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。
1951年, Lowry对此法进行了改善, 先于标本中加碱性铜试剂, 再与酚试剂反应, 提升了灵敏度。
原理
第一步: 双缩脲反应
在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色络合物,这个反应叫做双缩脲反应。因为蛋白质分子中含有与双缩脲结构相同多个肽键, 所以有双缩脲反应。
即在碱性溶液中, 蛋白质分子中肽键与碱性铜试剂中Cu2+作用生成紫红色蛋白质- Cu2+复合物。
原理
第二步: Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定, 其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝混合物)。因为蛋白质中含有带酚羟基酪氨酸( Tyr ) , 故有此显色反应。
即蛋白质- Cu2+复合物中所含酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中磷钼酸和磷钨酸, 生成蓝色化合物。
在一定浓度范围内, 蓝色深浅度与蛋白质浓度呈线性关系, 故与一样处理蛋白质标准液比色即可求出蛋白质含量。
即依据预先绘制标准曲线求出未知样品中蛋白质含量。
原理