SOD-MDA研究生实验.ppt

NBT 法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD) 活力植物组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA) 含量的测定 Planta , 2002, 215: 1022 背景知识?植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化: 如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。?生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O 2 .-)、羟自由基(OH ·)、过氧自由基(ROO ·)、烷氧自由基(RO ·)、过氧化氢(H 2O 2)、单线态氧(O 2 1)等。?活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用, 造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。?植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统: 酶促防御系统: SOD 、 CAT 、 POD 和 APX 等非酶促抗氧化剂: ASA 和 GSH 等?丙二醛(MDA) 是细胞膜脂过氧化作用的产物之一,它的产生还能加剧膜的损伤。因此,丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度,也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是一个常用指标。背景知识 NBT 法测定 SOD 活力实验目的?了解胁迫反应的具体机制(膜脂过氧化& 抗氧化) ?了解抗氧化防护酶的测定方法,掌握 NBT 法测定 SOD 活力实验原理? SOD 催化下列反应: 2O 2 .- +2H +→H 2O 2 +O 2 ?本实验依据 SOD 抑制氮蓝四唑( NBT )在光下的还原作用来确定酶活性大小。光 SOD H 2O 2 核黄素+甲硫氨酸 O 2 .- + NBT →甲腙( 560nm ) ?光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。 SOD 酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系,一般以引起 50%光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位材料、仪器设备及试剂植物生理生化实验 p172-173 ?(一)材料:小麦叶片?(二)仪器设备: ; ; ; ; 。?(三)试剂: mol/L 磷酸缓冲液 PBS ( ) 195 mmol/L 甲硫氨酸( Met )溶液 mmol/L 氮蓝四唑 NBT 溶液 100 u mol/L EDTA 溶液 60 umol/L 核黄素溶液实验步骤?1. 酶液提取: 取1 g 材料于预冷的研钵中,加 5 ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆, 15 000 g(4 ℃) 离心 15 min ,上清液即为 SOD 粗酶液。?2. 显色反应: 取 5ml 试管 4支, 2支为测定管,另 2支为对照管。反应体系中各试剂的终浓度为 130 mmol /L Met ,75 μ mol /L NBT ,4 μ mol /L 核黄素, 100 nmol /L EDTA ,按下列次序及量( ml )加入各溶液: 1 2 3 4 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液 核黄素 核黄素 核黄素 核黄素 Met 溶液 Met 溶液 Met 溶液 Met 溶液 EDTA 液 EDTA 液 EDTA 液 EDTA 酶液 酶液 缓冲液 缓冲液 NBT 溶液 NBT 溶液 NBT 溶液 NBT 溶液 ?3. 测定混匀后将 2支试管(不加酶液而用缓冲液,为最大还原管)设为对照, 其中 1支对照管置于暗处,其它 3支置 4000Lux 光 C2023 (或阳光) 下反应 20min (显蓝色),反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定 2支试管的 OD 560 SOD 活性计算? SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位表示,按下式计算 SOD 活性。(A ck-A E)×V A c