蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法.doc

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[ 实验目的] 学****掌握考马斯亮蓝法( Bradford 法)测定蛋白质含量的方法[ 实验原理](蓝色) 变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G595 250 max ???????[ 器材与试剂] 器材 722 型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管 16支试剂 1. 标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白( BSA ) ,配制成 。 2. 考马斯亮蓝 G-250 染料试剂:称 100mg 考马斯亮蓝,溶于 50ml 95% 的乙醇后,再加入 120ml 85% 的磷酸,用水稀释至 1 升。[ 实验方法] 标准方法 10 支试管, 分别编号后按表1 剂量依次加入标准蛋白( 或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。 2. 加完染料 20min 后,使用 722 分光光度计,塑料比色皿,在 595nm 处测量吸光度 A 595。 3. 用标准蛋白浓度( mg/ml ) 为横坐标,用A 595 为纵坐标, 进行直线拟合, 得到标准曲线。根据测得的未知样品的 A 595 ,代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度, 在标准曲线上查得相应的蛋白质含量, 按下式计算: 样品蛋白质含量(μ g/g 鲜重)=) 测定时提取液体积( ) 样品重( ) 提取液总体积( ) 查得的蛋白质( ml g ml gg??/? SDS 干扰实验 支试管, 分别编号后按表 2 剂量依次加入标准蛋白、 SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。 2. 加完染料 20min 后,使用 753 分光光度计,塑料比色皿,在 595nm 处测量吸光度 A 595。[ 实验数据与结果分析] (一)标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格管号 123456789 10 标准蛋白质( ) 0 未知蛋白质(约 ) 蒸馏水 0 0 考马斯亮蓝 G-250 试剂 对应的吸光度 A 595 根据表 1 ,以 A 595 为纵坐标,标准蛋白质量/(μg )为横坐标,作图 1。图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式 y =ax +b 计算所测溶液的蛋白质的含量。(二) SDS 干扰数据和图表2 考马斯亮蓝 SDS 干扰实验表格管号 123456 标准蛋白质( ) SDS (1mg/ml) 0 蒸馏水 考马斯亮蓝 G-250 试剂 对应的吸光度 A 595 根据表 2 ,以 A 595 为纵坐标, SDS 浓度为横坐标,作图 2。图2 考马斯亮蓝 SDS 干扰实验理论上, 十二烷基硫酸钠(SDS) 对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰, 随着 SDS 浓度的增加,其