蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法.doc

蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
《生物化学实验技术》课程作业
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法
[实验目的]
学****掌握考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量的方法
[实验原理]
考马斯亮蓝G-250染料+碱性氨基酸?磷酸??→λmax变为595nm(蓝色)芳香族
[器材与试剂]
器材
722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支
试剂
,用牛血清清蛋白(BSA),。
-250染料试剂:称100mg考马斯亮蓝,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85% 的磷酸,用水稀释至1升。
[实验方法]
标准方法
,分别编号后按表1 剂量依次加入标准蛋白(或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。
,使用722分光光度计,塑料比色皿,在595nm
处测量吸光度A595。
(mg/ml)为横坐标,用A595为纵坐标,进行直线拟合,得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595,代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:
样品蛋白质含量(μg/g鲜重) 查得的蛋白质(μg/g)?提取液总体积(ml)
=样品重(g)?测定时提取液体积(ml) 以蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。计算出回归方程。如Y=aX+b
让后把待测样品的吸光值代入回归方程,算出待测样品浓度
SDS干扰实验
,分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。
,使用753分光光度计,塑料比色皿,在595nm处测量吸光度A595。
[实验数据与结果分析]
(一)标准方法的数据和图
表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
《生物化学实验技术》课程作业
根据表1,以A595为纵坐标,标准蛋白质量/(μg)为横坐标,作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法
根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
(二)SDS干扰数据和图
表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格
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《生物化学实验技术》课程作业
根据表2,以A595为纵坐标,SDS浓度为横坐标,作图2。
图2 考马斯亮蓝SDS干扰实验
理论上,十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰,随着SDS浓度的增加,其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低,而后有一小段回升,最后趋于渐近线。
[结论]:
1. 考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。
2. 干扰考马斯亮蓝方法的物质中,SDS的干扰分析情况。
[干扰实验结果分析]:
当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加,吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机理来看,SDS可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量