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第十二章 基因工程
第一节 基因工程概述
遗传工程广义：细胞工程、染色体工程
细胞器工程、基因工程
酶工程、发酵工程
狭义：基因工程
基因工程概区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒的衍生载体，广泛用作植物基因工程中的载体：
（1）双元载体(binary vectors）
如pBin19载体，具有原核生物卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物选择标记，pUC19多克隆位点及α-互补显色标记
（2）共整合载体(integrated
vectors)
Ri质粒
Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。
T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括①T区的左右边界序列;②TL-DNA区;
③TR-DNA区。
（2）噬菌体载体
1、噬菌体；
2、噬菌体DNA；
3、噬菌体DNA中间
基因簇；
4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）
（3）克隆大片段DNA的载体

黏粒载体
克隆外源
片段的长
度在15～
45kb之间
细菌人工染色体(BAC)
上述的几种载体都不能携带大于50kb
外源DN***段，
而很多真核生
物基因长度在
50kb以上。细
菌人工染色体
载体就是为
克隆更大的外
源DN***段而
设计构建的
图12-9 细菌人工染色体载体pBAC
108L 及其多克隆位点。可插入达300kb
左右的DN***段
酵母人工染色体（YAC）
YAC载体可以插
入大片段的DNA
（1-2Mb），成为
人类基因组计划
（HGP）的一种
重要工具
三、基因分离方法
一个基因就是编码一条多肽链的一个DN***段
包括：启动子、终止子、内含子
外显子
1、基于文库的基因分离方法
基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因文库
（1）构建基因文库
基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组DNA群体
cDNA文库：以mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成cDNA，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成的基因库。克隆特定基因
（2）筛选基因库
利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库
筛选λ噬菌体构建的库常利用菌落杂交法：将经重组噬菌体感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑
图 12-10 菌落杂交技术
（3）阳性克隆的分析与鉴定
从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因
序列测定、生物信息分析
功能预测、功能鉴定
2、T-DNA标签克隆基因
利用T-DNA插入突变
创造突变体，获取目
标基因或克隆
T-DNA 载体构建
转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
筛选T2，获突变子，应为3:1分离
确定T-DNA与突变型共分离的个体
产生纯合后代
克隆T-DNA两侧的植物DNA
利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因
基因功能的验证（遗传互补测验，分离的
野生基因转化突变体，回复功能）
图12-11 T-DNA标签克隆基因的基本原理
3、基于PCR的基因克隆
原理：根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究
4、基因的人工合成
对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成
第三节 外源基因的导入
一、重组DNA技术
重组DNA：利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种
DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子
重组DNA技术主要步骤：
1) 从细胞或组织获得DNA并纯化
2) 用限制酶切割DNA
3) 将所得限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子
4) 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，
产生大量相同拷