荧光探针定量pcr技术原理及应用.doc

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荧光探针定量PCR技术原理及应用PCR技 z.
PCR临床应用出现问题，产物污染所致假阳性是主要原因之一。 基因的定量检测，扩展了临床应用空间传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度，产物就停顿了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；②PCR产物积累到一定程度就不能再增加，再进入平台期。为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反响管已进入平台期，终产物量并不代表样品目的基因含量；③PCR反响的管间扩增效率差异总是存在的，既然PCR产物呈指数增长，由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累，增加循环次数势必增加终产物的差异，而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。FQ-PCR采用实时检测，使所有含有不同数量的目的基因均在同一条件〔到达荧光阈值〕下进展分析，因而更具有可比性。而且，这一条件处于扩增产物指数积累初期，合成产物所需的dNTP、酶、离子均处于饱和的最正确状态，所以FQ-PCR循环参数与起始模板间有良好的线性关系〔相关系数＞〕，实现了极为准确的基因定量检测。 光谱技术进一步提高了灵敏度FQ-PCR 技术已用于单细胞基因诊断，灵敏度已到达极限水平，即检测单拷贝基因，而传统PCR是不易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。 荧光探针杂交，进一步提高了特异性PCR扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反响过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。 扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速FQ-PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也防止了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析。
3. 临床应用概要科学研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代。但对于许多疾病的发生和开展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。 感染性疾病PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的"窗口期〞问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。定量PCR研究资料已说明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究说明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床病症轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究说明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与*些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。 肿瘤尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍承受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进展肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量剩余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测，灵敏度低，一般需要到达108个分子数。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10-102*种标志物的mRNA，可大大提高检出率。一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。
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