植物组织培养实验报告.doc

植物组织培养实验报告
院(系、部) 化学与生物工程学院 专业 生物技术（师范） 年级13级 学号17130208 姓名 组别 第二组 课程名称 植物细胞工程学 实验日期 -保存在棕色玻璃瓶内。
6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。
NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。
各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
其他试剂的配置
1 mol/L 的NaOH：1瓶
1 mol/LHCL ：1瓶
%的升***或2%次***酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min)
70~75%酒精：每个超净工作台一瓶
95%酒精：每个超净工作台一瓶
75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶
培养基的配制与灭菌
培养基配制
配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5 mL；
溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中，加入蒸馏水400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至500 mL，搅拌均匀。
调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（～）测培养基的pH，（）。
培养基的分装  溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约50 mL 。每500 mL培养基，可分装10～15瓶。
培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。
培养基灭菌（高压灭菌）
放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。
其他灭菌
不耐热的物质将采用过滤灭菌
如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。
过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。
玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌
即利用烘箱加热到160-180℃ 的温度来杀灭微生物。
用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
接种室和超净工作台的灭菌处理
接种室熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。
甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。
对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸
准备组培室
将组培室打扫干净，调至适宜温度
超净工作台处理
材料准备
用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等
灭菌处理
实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。
注意：所有操作应在火焰