病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范.doc

题目: 病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范市一—病理科— 30 生效日期: 2012 年1月1日版本号 修改日期: 页码 1/ 13 病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范一、病理科免疫组织化学技术员培训规范: 凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学****培训, 经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1. 免疫组织化学染色前的准备事项(一) 组织切片的制备常规切片脱蜡至水(组织固定需用 10% 中性甲醛) (二) 抗体的选择、稀释和保存(1) 选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片( 石蜡切片抑或冷冻切片) 、稀释度和温育时间等〕。(2) 对于未曾使用过的新抗体, 应按照有关说明书的提示, 以几个不同的稀释度对适宜检材( 已知阳性切片/ 涂片) 进行预试验; 根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度,确定用于染色的最适稀释度(3) 抗体的原液应于分装后置于一 20℃冷室中保存,切勿反复冻存( 以免效价降低)。(4) 抗体的工作液可置于 4℃冰箱中保存。(5) 抗体的稀释。(1) 一般用 P BS( 生理盐水磷酸盐缓冲液), 。(2) 或用 TBS( 生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液), pH值 。(3) 必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三) 被检测组织内抗原的修复(1)经 4% 中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织,其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭,从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前, 对于组织切片进行抗原修复处理, 会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来,提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。(2) 抗原修复缓冲液。(l) 一般为 柠檬酸缓冲液( g 柠檬酸溶于 100 ml 蒸馏水中,用 2M NaOH 调节 pH 值至 ) 。(2) 有些抗体需要特殊修复缓冲液, 如高PH值的 EDTA (50 mM Tri s., 10 mM EDTA , pH9 .0) ,或商品化的该高题目: 病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范市一—病理科— 30 生效日期: 2012 年1月1日版本号 修改日期: 页码 2/ 13 pH 修复液等。(3) 抗原修复的常用方法。(l) 胰蛋白酶消化法:①组织切片脱蜡、水化。②滴加一滴 % 胰蛋白酶液于组织切片上。③ 37℃下温育 20-40 min( 温育时间取决于组织经 4% 中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。④蒸馏水冲洗,终止反应。⑤阻断内源性过氧化物酶。⑥进行免疫组织化学染色。( 配制 % 胰蛋白酶液时, 应将 g 胰蛋白酶溶于 0 .1% 无水***化钙水溶液(pH 值 ) 中。) ( 2) 胃蛋白酶消化法:①组织切片脱蜡、水化. ②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。③ 37℃下温育 10-30 min( 一般为 10min ,可延至 30min ,取决于组织经 4% 中性甲醛固定时间的长短). ④浸人蒸馏水,终止反应。⑤进行免疫组织化学染色。用 1% 胰蛋白酶液 37℃下处理 20min 。( 应以 HCI 配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片脱落。) ( 3) 微波修复抗原法:①组织切片脱蜡、水化( 硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。②将组织切片置于容器( 塑料盒或玻璃缸)中, 并向其中加人抗原修复液 200 ml, 盖上具有小孔的盖子。③将该容器置于微波炉(705 - 800W) 中央加热(95 ℃)5 min ,2次( 于两次之间,应向容器中添加蒸馏水 50ml ,严防组织切片干燥)。④将该容器移出微波炉,置于室温下冷却 15- 20min 。⑤蒸馏水冲洗。⑥阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。⑦用 TBS 或 PBS 液冲洗。⑧进行免疫组织化学染色。( 4) 热水浴法: 题目: 病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范市一—病理科— 30 生效日期: 2012 年1月1日版本号 修改日期: 页码 3/ 13 ①组织切片脱蜡、水化( 硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。②向装组织切片的容器加人足量( 例如 20 0ml) 抗原缓冲液,置于水浴锅中,加热至 95 - 99℃( 不沸腾) 预热。③将组织切片插人已预热的容器内,温育 20- 40min 。④将该容器由微波炉移出,置于室温下冷却 20min 。⑤室温下,用 TBS 、 PBS 或水洗。⑥蒸馏水冲洗。⑦阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。⑧用 TBS 或